[發明專利]測序方法

有效

• 申請號: 201180057746.0
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN103249843A
• 公開（公告）日: 2013-08-14
• 發明（設計）人: 賈爾勒·科特斯巴克
• 申請（專利權）人: 金希克股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 余剛;張英

1.一種用于確定固定在固體載體上的單一多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括以下步驟：

（i）使所述多核苷酸與至少一種測試互補堿基和/或至少一種探針接觸，所述探針包括可與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補的部分，珠粒連接至所述至少一種測試互補堿基和/或至少一種探針或者結合對的第一結合伴侶連接至所述至少一種測試互補堿基和/或至少一種探針，并且當所述測試互補堿基和/或所述測試互補探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補時，所述測試互補堿基和/或探針共價結合至所述多核苷酸；

（ii）當結合伴侶連接至所述測試互補堿基和/或探針時，通過所述結合對，將連接至所述結合對的第二結合伴侶的珠粒結合至所述測試互補堿基和/或探針，所述第一結合伴侶連接至所述測試互補堿基和/或探針；

（iii）可選地，使用至少一種不同的測試互補堿基和/或探針，重復步驟（i）、或步驟（i）與步驟（ii），直到與所述一個或多個堿基互補的測試堿基和/或其部分與所述一個或多個堿基互補的測試探針已結合至所述多核苷酸；

（iv）通過確定步驟（i）至步驟（iii）期間連接至所述測試互補堿基和/或探針的所述珠粒是否結合至所述多核苷酸，來確定哪種測試互補堿基和/或所述測試探針的哪個互補部分結合至所述多核苷酸的所述一個或多個堿基，從而識別所述多核苷酸的所述一個或多個堿基；以及

（v）如果在步驟（iv）期間沒有除去珠粒，則除去所述珠粒；

其中，步驟（i）至步驟（v）的每一個循環進行一次或多次，并且在每一個循環中識別所述序列的一個或多個堿基。

2.根據權利要求1中所述的方法，其中，至少進行兩次循環。

3.根據權利要求1或2中所述的方法，其中，通過連接或聚合進行所述互補堿基和/或所述探針的共價結合。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述方法是通過合成測序、通過連接測序或通過逐步連接和切割測序中的一種。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述方法包括以下步驟：

（i）使所述多核苷酸與至少一種測試探針以及可選地至少一種測試互補堿基接觸，至少一種所述測試探針包括可與所述多核苷酸中的一個或多個堿基互補的部分，至少一種所述測試互補堿基可與所述多核苷酸中的堿基互補，珠粒連接至至少一種所述測試探針或至少一種所述測試互補堿基，或結合對的第一結合伴侶連接至至少一種所述測試探針或至少一種所述測試互補堿基，并且當所述測試互補堿基和/或所述測試互補探針的部分與所述多核苷酸中的所述一個或多個堿基互補時，通過將所述探針連接至所述多核苷酸，將所述測試互補堿基和/或探針共價結合至所述多核苷酸；

（ii）當結合伴侶連接至所述測試互補堿基和/或探針時，通過所述結合對，將連接至所述結合對的第二結合伴侶的珠粒結合至所述測試互補堿基和/或探針，所述第一結合伴侶連接至所述測試互補堿基和/或探針；

（iii）可選地，使用至少一種不同的測試互補堿基和/或探針重復步驟（i）、或步驟（i）與步驟（ii），直到與所述一個或多個堿基互補的測試堿基和/或其部分與所述一個或多個堿基互補的測試探針已結合至所述多核苷酸；

（iv）在每一步驟（i）、或步驟（i）與步驟（ii）之后、或在步驟（iii）之后，如果所述測試探針結合至所述多核苷酸，則加入能夠除去所述珠粒的酶，所述酶通過切割反應除去至少一部分的所述測試探針和待測序的多核苷酸的至少一個堿基；以及

（v）通過確定步驟（i）至步驟（iii）期間連接至所述測試互補堿基和/或探針的所述珠粒是否結合至所述多核苷酸，來確定哪種測試互補堿基和/或所述測試探針的哪個互補部分結合至所述多核苷酸的所述一個或多個堿基，從而識別所述多核苷酸的所述一個或多個堿基；

其中，步驟（i）至步驟（v）的每一個循環進行一次或多次，并且在每一個循環中識別所述序列的一個或多個堿基。

6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述酶是核酸酶，所述核酸酶具有不同于其識別位點的切割位點，并且所述測試探針包括針對所述核酸酶的識別位點。

7.根據權利要求6中所述的方法，其中，所述酶是限制酶，優選是IIb型限制酶。

8.根據權利要求1至7中任一項所述的方法，其中，在步驟（iv）中依次使用各自能夠從不同的測試互補探針中除去珠粒的多種酶。