[發明專利]用于在絲狀真菌子實體中產生異源蛋白的調控元件

有效

• 申請號: 201180051472.4
• 申請日: 2011-08-30
• 公開（公告）號: CN103180433A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: Z·石;J·Q·威爾金森;D·S·瓦爾特斯;C·P·羅曼
• 申請（專利權）人: 英特拉克森公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;C07H21/04
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及真菌基因表達的調控領域。新組合物和方法可用于通過本領域技術人員已知的重組技術來改善真菌物種，如改善病原體、害蟲以及殺蟲劑抗性，產量和質量，延長生產保存期限，提高烹飪、營養以及醫藥價值等，以及改善異源蛋白的工業化生產。

背景技術

約40%商購可獲得的酶來源于絲狀真菌。Lowe,Handbook?of?Applied?Mycology.Fungal?Biotechnology(eds.)Arora,D.K.Elander,R.P.&Mukerji,K.G.681-708(Marcel?Dekker,New?York;1992)。這些酶通常由曲霉屬(Aspergillus)和木霉屬(Trichoderma)的物種產生。因為它們向培養基中分泌大量蛋白，它們可以在大規模發酵時生長，并且通常認為它們對于食品工業是安全的。

與商業栽培蘑菇(雙孢蘑菇(Agaricus?bisporus))相關的一般問題包括，病原體如菌生輪枝菌(Verticillium?fungicola,干泡病)、侵占木霉(Trichoderma?aggressivum,綠霉)、托拉氏假單胞菌(Pseudomonas?tolaasii，斑)和dsRNA病毒(勒法郎士病(La?France?disease)和斑病(patch?disease))引起的疾病、主要蟲害[尖眼蕈蚊(sciarid?fly)(尖眼蕈蚊(Lycoriella?mali))]、與細菌性腐敗和快速衰老有關的產品的極短保存期限以及與內源多酚氧化酶(PPO，如酪氨酸酶)的作用有關的子實體褐變(擦傷)。為了進一步提高產品質量，雙孢蘑菇的常規育種程序僅僅是適度成功的，并且長期而言是不足夠的。這是因為真菌的常規育種技術非常耗時，并且因為商購可獲得菌株的遺傳變異受到限制，從而提供很小的通過選擇的改進(Horgen?et?al.“Homology?between?mitochondrial?DNA?of?A.bisporus?and?an?internal?portion?of?a?linear?mitochondrial?plasmid?of?Agaricus?bitorquis”Curr?Genet.1991.19:495-502)。

對于雙孢蘑菇而言，有效育種策略的主要障礙是涉及任一親本核異常地同時分離成一個擔孢子的相當異常的生活史。在這種擔孢子長出后，形成異核菌絲，其所含有的核和遺傳特征與親本菌絲中存在的核和遺傳特征并無不同。此外，在減數分裂期僅觀察到很少的重組活性(Summerbell?et?al.Genetics,Oct.123(2)1989?pp.293-300)。

為了克服常規育種的局限性，全世界的研究人員試圖為商業蘑菇如雙孢蘑菇開發和改善用于引入新特性的轉化方法。對于其他真菌以及植物、動物和細菌而言，應用基因轉移技術是相當常見的，并且已經導致商業應用。

為了提高微生物如真菌產生蛋白的經濟性，已經做了大量努力來提高轉錄和翻譯效率、最大化針對期望的產物產生的總蛋白的比例，提高修飾的宿主的生存力，并提高獲得修飾的宿主的效率。目前用于真菌轉化的主要啟動子是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)啟動子。利用強啟動子在適當的宿主中表達異源基因是生物技術應用的主要策略。Gpd啟動子是可以通過任何碳源誘導的強啟動子，并且已經廣泛用于在釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)以及其他酵母中表達異源蛋白。