[發(fā)明專利]細(xì)胞培養(yǎng)用一次性器具、細(xì)胞培養(yǎng)裝置及細(xì)胞制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201180032556.3
• 申請(qǐng)日: 2011-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN102971411A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 小林明;市村昌紀(jì);中谷勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 株式會(huì)社鐘化
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00;C12N5/02
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 金世煜;趙曦

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于將有用細(xì)胞的分離工序、分離的有用細(xì)胞的培養(yǎng)工序及培養(yǎng)的細(xì)胞的清洗·濃縮工序全部連貫地進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)用一次性器具（disposable?set）、細(xì)胞培養(yǎng)裝置及細(xì)胞制備方法。

背景技術(shù)

近年來，從患者本人或者提供者的體液、組織采集細(xì)胞并通過培養(yǎng)將其擴(kuò)增、加工而向患部進(jìn)行移植的治療的所謂再生醫(yī)療·細(xì)胞醫(yī)療正受到重視。對(duì)于再生醫(yī)療·細(xì)胞醫(yī)療而言，在許多情況下，在從由體液、組織采集的細(xì)胞群之中分離出被用于治療的有用細(xì)胞后，通過培養(yǎng)實(shí)施細(xì)胞擴(kuò)增。培養(yǎng)得到的細(xì)胞可向皮膚、骨、軟骨、角膜等進(jìn)行移植，在它們的部分疾病中顯示出其安全性和有效性，作為有益于患者的治療方法，期望得到普及（例如，參照非專利文獻(xiàn)1）。

近年來逐漸清楚：在骨髓液、臍帶血等中，存在具有能夠分化成骨、軟骨、肌肉、脂肪等多種細(xì)胞的性質(zhì)的附著性成體干細(xì)胞（例如，參照非專利文獻(xiàn)2～4）。由于成體干細(xì)胞具有能夠分化成多種多樣的細(xì)胞、臟器的能力，因此使成體干細(xì)胞效率良好地分離、擴(kuò)增的方法從再生醫(yī)療發(fā)展的角度來看是極為重要的?，F(xiàn)在，就成體干細(xì)胞的分離而言，F(xiàn)icoll?Paque分離法（例如，參照非專利文獻(xiàn)5）等密度梯度離心法是主流，但該方法為了將分離液與細(xì)胞分開而使用離心分離器，需要反復(fù)清洗細(xì)胞這樣煩雜的操作，進(jìn)而，伴隨著由離心操作所致的對(duì)細(xì)胞的損害、由開放體系中的操作所致的污染的危險(xiǎn)。

另外，分離的成體干細(xì)胞被報(bào)道在骨髓液的有核細(xì)胞中存在頻率非常小，對(duì)于成人而言在10⁴～10⁶個(gè)中存在1個(gè)（例如，參照非專利文獻(xiàn)5），需要通過培養(yǎng)而使之增殖到治療所必需的數(shù)量。現(xiàn)在，成體干細(xì)胞的擴(kuò)增一般是使用器皿、燒瓶、或者培養(yǎng)袋、培養(yǎng)用盒（cartridge）等，在CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃的溫度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。這種情況下，由于培養(yǎng)基更換、傳代操作是人實(shí)施，因而每次進(jìn)行這些操作都要有污染的風(fēng)險(xiǎn)、操作時(shí)間。

因此，近年來開發(fā)出自動(dòng)地實(shí)施細(xì)胞播種、培養(yǎng)基更換等培養(yǎng)操作、幾乎不耗費(fèi)人工的自動(dòng)培養(yǎng)裝置（例如，參照專利文獻(xiàn)1～3）。然而，現(xiàn)在的自動(dòng)培養(yǎng)裝置裝載的僅是自動(dòng)地培養(yǎng)所需細(xì)胞的功能，而沒有裝載將所需細(xì)胞從體液或者組織分離這樣的功能。

另外，使目標(biāo)細(xì)胞增殖到規(guī)定數(shù)量后，進(jìn)行胰蛋白酶等酶處理、2價(jià)陽離子螯合劑等處理，將細(xì)胞從培養(yǎng)容器中剝離，剝離的細(xì)胞與這些酶液一起被回收，因此，需要另行進(jìn)行除去胰蛋白酶等酶、2價(jià)陽離子螯合劑的操作。

現(xiàn)在，作為最一般的細(xì)胞清洗方法，有離心分離法。本方法是以下方法：通過離心分離操作，使細(xì)胞沉淀，除去上清后，加入新的清洗液，將細(xì)胞再懸濁，再次進(jìn)行離心分離操作，通過重復(fù)本操作，從而進(jìn)行細(xì)胞的清洗。但是，被指出該操作煩雜、封閉體系中的分離操作不容易等細(xì)胞清洗工序中的污染風(fēng)險(xiǎn)。

另外，有使用無紡布等分離材料捕捉培養(yǎng)的細(xì)胞并回收清洗后的細(xì)胞的方法（例如，參照專利文獻(xiàn)4），但是與離心分離法同樣，這樣的技術(shù)是單獨(dú)使用的，并非能夠在1個(gè)裝置中實(shí)施特定細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、回收。

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2004-344128號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2：日本特開2004-089095號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)3：日本特開2001-275659號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)4：日本特開2008-086235號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：Robert?Paul?Lanza等著,大野典也等監(jiān)譯，“再生醫(yī)學(xué)～從Tissue?Engineering的基礎(chǔ)到最前端技術(shù)~”，株式會(huì)社NTS，2002年

非專利文獻(xiàn)2：Pliard?A.et?al.,Controlled?Conversion?of?anImmortilized?Mesodermal?Progenitor?Cell?Towards?Osteogenic,Chondrogenic,or?Adipogenic?Pathways.,J.Cell?Biol.130(6),pp.1461-72,1995

非專利文獻(xiàn)3：Mackay?A.M.et?al.,Chondrogenic?differentiationof?cultured?human?mesenchymal?Stem?Cells?from?Marrow,TissueEngineering?4(4),pp.414-428,1998