[發(fā)明專利]稀有細胞的磁性分離

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201180006892.0
• 申請日: 2011-01-20
• 公開（公告）號: CN102762712A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 阿哈龍·拉米什;科弗·克萊因
• 申請（專利權(quán)）人: 百賽普有限公司
• 主分類號: C12M1/42
• 分類號: C12M1/42;C12M1/00
• 代理公司: 北京康信知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 余剛;吳孟秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分離包括細胞的粒子。本發(fā)明的一些實施例涉及稀有細胞的磁性分離。

背景技術(shù)

在文獻（例如美國專利4,710,472和其中引用的多個出版物）中描述了大量涉及生物細胞的磁性分離的申請。許多這樣的申請不但需要分離一種或多種特殊類型的細胞（以下簡稱“靶細胞（target?cell）”），還需要維護靶細胞和/或非靶細胞中細胞膜的品質(zhì)。因此，在正向選擇過程中，使靶細胞與用于檢查或用于研究、診斷或臨床目的的樣品分離；而在去除過程中，該樣品耗盡了用于檢查的靶細胞或使用了非靶細胞。使靶細胞與非靶細胞分離，以及維護靶細胞和非靶細胞的薄膜，對目前正在利用淋巴細胞群處理的研究以及早期癌癥檢測是尤其重要的。

目前，用于分離生物細胞的一項技術(shù)使用MiniMACS分選柱（separation?columns）（Miltenyi?Biotec?GmbH，德國美天旎生物技術(shù)有限公司）。該項技術(shù)使用極其小且直徑大約為50nm（即與病毒尺寸相比體積比真核細胞小大約100萬倍）的順磁微珠。這樣的磁微珠被制造具有某些細胞（即，靶細胞）的選擇性親和力，以便對靶細胞進行磁性標(biāo)記或染色。將所述樣品引入包括透水磁體的磁選柱中，例如，鋼絲綿或鋼絲網(wǎng)，并且向整個柱上施加磁場，使得將磁性染色細胞保持在柱的透水磁體中，同時未染色的細胞穿過該柱。然而在該已知過程中，發(fā)現(xiàn)細胞膜被透水磁體過度損壞，降低了研究或臨床用技術(shù)的有效性。

在某些情況下，靶細胞在樣品中很罕見，諸如，給分離過程帶來挑戰(zhàn)的癌細胞、干細胞或胎細胞。下面參照胎細胞，作為非限制實例。

人們對母體血液中存在胎細胞的了解已超過一個世紀，因為Schmorl（1）展示了在死于子癇的女性的肺循環(huán)中的滋養(yǎng)層細胞。從那以后，已經(jīng)證明五種不同的胎細胞類型在母體血液中循環(huán)，包括滋養(yǎng)層細胞（1）、淋巴細胞（2）、有核紅血球（NRBC）（3）、粒細胞（4）、干細胞（5）。胎細胞在母體循環(huán)中的頻率很低，經(jīng)定量PCR技術(shù)（6）檢測，平均為每毫升母體血液具有1.2個細胞。在與母體血液隔離的所有胎細胞類型之中，NRBC作為用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷（7）的最佳候選細胞。

研究人員一直試圖利用熒光激活細胞分類術(shù)法（FACS）和磁珠細胞分選法（MACS）胎兒NRBC的分離和富集（enrichment），包括由NIH資助的大規(guī)模研究（NIFTY研究）。該項研究實現(xiàn)了低靈敏度的胎細胞檢測，F(xiàn)ACS的回收率為13%，MACS的回收率為44%（領(lǐng)先的磁選技術(shù)）（8），并得出這樣的結(jié)論：當(dāng)母體血液中胎兒NRBC的比例低，且現(xiàn)有分離技術(shù)的回收率低時，F(xiàn)NRBC并不適用于臨床應(yīng)用。由于分離這些細胞是極其困難的，所以采用基于不同遺傳物質(zhì)諸如DNA片段（9）的替代且不太有效的方法。這些物質(zhì)必須利用PCR加倍，以對其進行有效分析，且不能提供與FNRBC可能具有的三體有關(guān)的決定性結(jié)果水平相同的水平。

對于本發(fā)明的某些發(fā)明人及其他人，美國專利6,482,328公開了一種使所選類型的靶粒子與樣品磁性分離的方法和設(shè)備，以便濃縮樣品中的靶粒子，或相對于靶粒子而耗盡樣品，這是通過制造帶有具有選擇性親和力的磁粒子的樣品的樣品混合物以對靶粒子進行磁性染色而實現(xiàn)的。

仍然迫切需要對高產(chǎn)率、高純度的稀有活細胞進行快速、可靠的磁分離。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種快速、高效定性定量地使稀有細胞與流體樣品磁性分離的系統(tǒng)，該流體樣品具有相對于其余細胞的較低豐度的稀有細胞，同時，保持細胞活力。

例如，稀有細胞包括地中海貧血患者體內(nèi)存在的有核紅細胞（NRBC），或母體循環(huán)中存在的胎兒有核紅細胞（FNRBC）、外周血中的癌細胞、胎兒或成體干細胞或在循環(huán)內(nèi)由CD71，CD8，CD34或CD133表征的細胞。

在某些實施例中，該分離提供了足夠濃度和/或數(shù)量的稀有細胞，以對所述細胞或其部分進行顯著的可靠的臨床分析、遺傳分析、化學(xué)分析或其他分析。

例如，孕婦循環(huán)中的胎兒有核紅細胞相對其他細胞來說極為罕見，大約100ppb或更少，阻礙了對胎兒細胞或DNA進行可靠的遺傳分析。根據(jù)在本文中公開的方法，可以從常規(guī)血液樣品中獲得充分或足夠數(shù)量的FNRBC，諸如，樣品中存在的95%以上的FNRBC。因此，該方法能夠進行有效分離，且所獲得的細胞隨后可以根據(jù)技術(shù)中已知的可用方法中的一種方法而用于遺傳分析或診斷。