[發明專利]一種采用戊二醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme435的方法

有效

• 申請號: 201110460474.0
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102533710A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王普;何軍邀;黃金;梁法勇
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術領域

本發明涉及一種采用戊二醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme?435的方法，以及采用修飾后的脂肪酶Novozyme?435催化外消旋2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體(S)-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸。?

(二)背景技術

S-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中間體。西司他丁(Cilsatatin)化學名：(+)-(Z)-7-[(2R)-(2-氨基-2-羧基乙基)硫]-2-[(1S)-(2，2-二甲基環丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一個應用于臨床的腎脫氫二肽酶抑制劑。西司他丁與碳青霉烯類抗生素亞胺培南(Imipenem)制成的復合劑泰能?(Tienam)既有極強的廣譜抗菌活性，又具β-內酰胺酶抑制作用，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌均有較強的抗菌作用，特別適用于治療多種菌聯合感染以及需氧菌和厭氧菌的混合感染，是目前臨床應用最廣泛的抗生素和治療未知重癥感染的王牌藥物之一。?

制備S-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸的方法主要有化學法和生物法。王普等采用脂肪酶Novozyme?435(即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解合成西司他丁關鍵手性中間體S-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸，可獲得45.6％的產率，產物光學純度為99.2％。脂肪酶Novozyme?435重復使用4次后，產率下降至25.8％，僅為初次催化產率的56.5％，ee值為96.9％(脂肪酶Novozyme?435選擇?性催化2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸.催化學報.2010，31(6)：651-655)。由于Novozyme?435為南極假絲酵母脂肪酶B(即脂肪酶CAL-B)經大孔吸附樹脂吸附制得的固定化酶，在反應過程中會出現酶分子脫落現象，從而造成酶回收量的減少，影響酶的重復使用效果，從而影響該生物拆分過程的催化劑成本。?

(三)發明內容

本發明目的是進一步提高脂肪酶Novozyme?435(即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯不對稱水解的酶活性和穩定性，通過對脂肪酶Novozyme?435進行戊二醛交聯的“酶二次修飾”，提高該酶的穩定性，改善其催化活性，提高重復使用次數。?

本發明采用的技術方案是：?

一種采用戊二醛交聯固定化修飾脂肪酶Novozyme?435的方法，所述方法包括：將脂肪酶Novozyme?435以10g/L～20g/L添加量，加入質量濃度0.5％～10％的戊二醛溶液中，在20～50℃、40～240rpm下進行化學交聯15～120min，交聯反應結束后，用蒸餾水充分洗去未反應的戊二醛，干燥得到戊二醛交聯修飾后的脂肪酶Novozyme?435。所述的脂肪酶Novozyme?435購自丹麥諾和諾德公司(Novo?Nordisk，Bagsvard，Denmark)。?

戊二醛與酶分子中的氨基結合，使酶分子固定化，從而提高酶的穩定性，但加入過量的戊二醛也會破壞酶分子的結構，引起酶的失活。因此，在進行戊二醛交聯反應時，需要選取適當的戊二醛濃度，既保證酶的修飾所需，同時又盡可能減少因過高戊二醛濃度造成的酶分子失活，以提高酶的穩定性。?

所用戊二醛溶液質量濃度優選為0.5％～3.0％。?

優選的，所述交聯反應在30～35℃、120～240rpm下進行。?

采用戊二醛交聯后的脂肪酶Novozyme?435為生物催化劑，以外消旋2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯為底物，于水相反應體系中，pH?6.0～8.0、20～50℃下進行酶催化不對稱水解反應，反應結束后，反應液經分離得到產物(S)-(+)-2，2-二甲基環丙烷甲酸。?

該水相反應體系通常可以是pH?6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液，即所述的反應是將2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯與戊二醛交聯修飾后的脂肪酶Novozyme?435加入pH值為6.0～8.0的磷酸緩沖液中進行水解反應，通常反應條件為：搖床轉速為40～240rpm，pH?6.0～8.0、20～50℃，反應時間為0～80h，所述的2，2-二甲基環丙烷甲酸乙酯的添加量為5g/L～20g/L磷酸緩沖液，所述的交聯修飾脂肪酶Novozyme?435添加量為10g/L～20g/L磷酸緩沖液。?

所述的產物產率和產物e.e.值測定采用氣相色譜法。反應結束后，反應液用兩倍體積乙酸乙酯萃取，定容后采用氣相色譜分析。?