[發明專利]一種利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法

有效

• 申請號: 201110460151.1
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102524070A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 耿鑫鑫;周偉軍;許玲;王兵
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取甘藍型油菜的花序作為小孢子培養的供體植株；

(2)從所述供體植株上取花蕾并滅菌，再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養基中，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀，在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液體培養基、秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液；

所述的NLN-13液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，蔗糖130g，pH?5.6～6.2；所述含PEG6000的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L、蔗糖1～65g和62.5～250g?PEG6000，pH?5.6～6.2；所述秋水仙堿溶液的質量百分濃度為0.3～0.8％；所述活性炭混合液，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，瓊脂糖2～5g和活性炭8～15g；

(3)將所述小孢子混合懸浮液在黑暗條件下于30～33℃恒溫熱激處理0～3天，后取出在黑暗條件下于22～28℃培養10～15天，直至肉眼可見時，在黑暗條件下于22～28℃搖動培養5～10天，得到子葉期胚狀體；

(4)將所述子葉期胚狀體接種至分化培養基中，在每天12～18小時光照和22～28℃下培養，形成再生芽；其中，所述分化培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，脫落酸2～4mg，萘乙酸0.2～0.5mg，蔗糖25g，瓊脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0；

(5)切取再生芽接種至生根培養基上，在每天12～18小時光照和22～28℃條件下進行生根培養，將根生長健壯的苗經煉苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鑒定倍性；其中，所述生根培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，萘乙酸0.5～1mg，蔗糖25g，瓊脂6.5～7.5g，pH5.6～6.0。

2.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，所述的花蕾為花序上花瓣和花藥長度比為0.5～0.7、單核晚期至雙核早期的花蕾。

3.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，所述步驟(2)為：從所述供體植株上取花蕾并滅菌，再將滅菌后的花蕾加入到NLN-13液體培養基中研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉淀后；在沉淀中再次加入NLN-13液體培養基研磨成懸浮液，再次過濾所得濾液經離心、棄上清液，再次得到沉淀；在所述沉淀中依次加入含PEG6000的NLN液體培養基、秋水仙堿溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。

4.如權利要求1或3所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的過濾采用44μm無菌濾網。

5.如權利要求1或3所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的離心的條件為：900～1200rpm離心3～5min。

6.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(3)中，在黑暗條件下培養溫度為25±2℃。

7.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(3)中所述子葉期胚狀體在3℃～8℃保存。

8.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(4)中，培養條件為每天16小時光照和25℃下培養，培養時間為20～30天。

9.如權利要求1所述的利用PEG作為滲透調節劑的小孢子培養方法，其特征在于，步驟(5)中，培養條件為每天16小時光照和25℃下培養，培養時間為25～30天。