[發明專利]負載重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的樹突狀細胞疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201110459444.8
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102552902A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 鄭駿年;李慧忠;李連濤;張寶福;劉俊杰;張青;楊潔;章龍珍;裴冬生
• 申請（專利權）人: 鄭駿年
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61P35/00;C12N5/0784;C07K19/00
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明涉及生物化學領域中的多肽技術及醫學免疫學領域的疫苗技術，更具體的說，涉及一種新的重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的樹突狀細胞疫苗的制備。

背景技術

腫瘤治療仍是世界性的難題，傳統的治療方法難以解決腫瘤術后復發和轉移，1985年美國國家癌癥中心把腫瘤生物治療列入腫瘤治療的第四大模式。近年來腫瘤疫苗發展迅速，尤其是樹突狀細胞(DC)疫苗被認為是最具發展前景的治療技術。

制備理想的腫瘤疫苗首先要選擇合適的腫瘤抗原。Ki-67是在增殖細胞中表達的一種核抗原，與細胞的有絲分裂有關。Ki-67在多種腫瘤組織中高表達，使其已成為檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標。近年發現Ki-67表達與腫瘤的惡性程度及預后有關，在惡性腫瘤侵襲、轉移過程中起重要作用，是腫瘤治療新的靶點。鑒于Ki-67是一理想的腫瘤抗原，前期研究中我們運用BIMAS和SYFPEITHI抗原表位預測軟件，對人Ki-67抗原片段的CTL表位綜合評分，得出分值較高的7個Ki-67候選肽，通過T₂結合實驗證實，位于Ki-67的280-288位置的LQGETQLLV多肽與HLA-A*0201分子具有高親和力。用候選肽刺激HLA-A*0201陽性人外周血單個核細胞，通過檢測IFN-γ分泌，證實該肽可以誘導特異性CTL活化，免疫原性良好。

在DC疫苗的設計過程中，佐劑的應用、抗原的免疫原性及抗原負載體系是影響疫苗療效的重要參數。研究表明單純抗原多肽的自身穩定性差，以及其與MHC?I類分子的親和力低是影響DC疫苗的重要因素，直接導致其不能有效激發特異性免疫應答。

近年來gp96作為一種天然的免疫佐劑在腫瘤疫苗的研究中備受關注。gp96(glycoprotein?96，gp96)是熱休克蛋白(heat?shock?protein，HSP)家族中研究和應用最廣泛的一員，廣泛存在于細胞內質網中。研究發現其在免疫反應中參與交叉激活，并起到佐劑作用。通過生化技術在體外觀察到，與gp96結合的抗原肽可由抗原遞呈細胞表面的通用受體CD91遞呈給MHC?I分子，并引起抗原肽特異性CTL活化；誘導DC細胞成熟；促進T細胞、巨噬細胞和DC向腫瘤細胞浸潤，刺激Th1細胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-12)表達，以增加腫瘤細胞的免疫原性。

2005年6月，歐洲藥品監管機構批準了HSPPC-96(Oncophage，Antigenics公司)應用于腎細胞癌治療。HSPPC-96是自體腫瘤來源的gp96-抗原肽復合物合成制劑，它是用切除的癌組織制備而得。該制劑皮下注射可以使DC刺激NK細胞和T細胞，并引起記憶性免疫應答。目前正進行腎細胞癌和轉移性黑色素瘤III期臨床試驗。雖然自體腫瘤組織來源的gp96-抗原肽復合物疫苗取得了明顯的臨床療效，但在具體制備和應用過程中存在以下問題。首先gp96-肽復合物的純化工序復雜、產量低，難以滿足臨床免疫治療的需求，而且純度和制劑保存方面存在許多難題；其次，腫瘤組織的獲取、分離、純化在一定程度上限制了疫苗的來源。

Blachere研究證實，在體內和體外組裝形成的gp96多肽復合物均能被抗原遞呈細胞攝取、加工，并通過MHC?I類途徑提呈給腫瘤特異性的CTL。

發明內容

本發明提供一種負載重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的樹突狀細胞疫苗的制備方法。

本發明的技術方案是：一種負載重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的樹突狀細胞疫苗的制備方法，以腫瘤普遍表達的Ki-67作為抗原，將人工合成的Ki-67抗原的CTL表位肽與重組人gp96肽體外結合，制備gp96抗原肽復合物；將此復合物與體外誘導的樹突狀細胞共孵育，從而獲得負載重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的樹突狀細胞疫苗。該樹突狀細胞疫苗具有腫瘤治療和預防復發作用。該樹突狀細胞疫苗的制備包括如下步驟：

(1)重組人gp96蛋白(rhGrp94)合成；

(2)采用固相合成法制備Ki-67抗腫瘤CTL表位肽；

(3)重組人gp96-Ki67抗原肽復合物的制備；

(4)體外誘導樹突狀細胞；

(5)重組人gp96-Ki67抗原肽復合物與樹突狀細胞共同孵育培養，獲得樹突狀細胞疫苗；

(6)樹突狀細胞疫苗功能驗證。

本發明技術方案的理論基礎如下：