[發明專利]一種農桿菌介導的小麥遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201110459360.4
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102533845A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李新玲;閆玉清;徐香玲
• 申請（專利權）人: 哈爾濱師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種農桿菌介導的小麥遺傳轉化方法。

背景技術

小麥是人類賴以生存的重要禾谷類作物之一，在世界范圍內種植面積及總產量均超過了其它農作物，它的遺傳改良始終是人們努力的重要目標。傳統的小麥育種技術存在著育種周期偏長、增產潛力有限等局限性，隨著生物技術的發展，利用基因工程技術對小麥進行品種改良越來越受到重視。在植物基因轉化系統的研究方面，小麥相對于其它禾谷類作物如水稻、玉米等，表現出滯后性和困難性。小麥遺傳轉化研究始于20世紀80年代末期，由于小麥不是農桿菌的天然宿主，且小麥原生質體再生又相對困難，所以直到1992年Vasil等人成功地將GUS和Bar基因通過基因槍法導入小麥胚性愈傷組織，并獲得轉基因植株以后，有關小麥轉基因的報道才開始增多。目前，轉基因水稻已經進入中間試驗和安全性評價階段，而小麥轉基因的研究明顯落后，還處于轉化體系的建立和完善階段。

植物基因工程中，利用農桿菌介導的基因轉移是目前研究的最多、轉化機理最清楚、技術方法最成熟的基因轉化途徑。與基因槍轉化法相比，農桿菌轉化法具有很多的優勢，如可以導入大片段目的基因，且目的基因多為單拷貝或低拷貝；容易排除冗余的質粒DNA序列；插入邊界多為T-DNA的邊界序列，重排率低等。能否將這一方法用于小麥等單子葉植物的基因轉移成為90年代前后研究的熱點。當時，一種傾向性的觀點是認為單子葉植物不是農桿菌的天然寄主，利用農桿菌介導轉化單子葉植物幾乎不可能或沒有可能性。這種觀點的代表人物是曾在小麥等禾谷類作物組織培養與基因槍轉化方面卓有建樹的瑞士科學家Potrykus，他在國際權威雜志Bio/Technology和Nature上發表了他的悲觀論點。隨著農桿菌介導的石刁柏轉基因植株的獲得，特別是農桿菌介導的轉基因水稻和轉基因玉米植株的獲得，不僅改變了單子葉植物不是農桿菌天然寄主的觀點，而且證明農桿菌介導法完全可以用于禾本科作物的遺傳轉化。然而，迄今為止小麥的農桿菌轉化仍然是世界上的一道難題。近年來，國內外很多的研究小組從小麥基因型、農桿菌菌株、共培養條件、外植體類型等多角度進行了大量的研究和探索，提出了很多套遺傳轉化體系，但都沒有任何一套能被廣泛的使用。

目前，用于農桿菌介導轉化的小麥外植體多為幼胚和成熟胚所形成的胚性愈傷組織，它們均需經過離體組織培養再生出轉基因植株。然而，小麥的不同基因型對于植株的再生有著很大的影響，這進一步限制了通過組織培養途徑獲得轉基因小麥。

發明內容

本發明的目的是提供一種農桿菌介導的小麥遺傳轉化方法，該方法不經過愈傷組織形成的步驟，具有適應性廣、操作簡單、轉化周期短的優點。

本發明所提供的方法是通過農桿菌介導將目的DNA轉入小麥細胞，包括如下步驟：

1)將含有目的DNA的重組農桿菌接種于小麥幼胚，然后將接種后的所述小麥幼胚進行共培養使所述重組農桿菌的T-DNA與所述小麥的染色體整合；

2)將經過步驟1)共培養的所述小麥幼胚直接接種于長苗培養基中培養，即得到具有根、莖和葉的幼苗。

在上述方法中，為了防止小麥幼胚經農桿菌侵染后易褐化死亡，在步驟1)所述將含有目的DNA的重組農桿菌接種于小麥幼胚之前，所述小麥幼胚還經過12-24小時、如24小時的預培養；

所述預培養具體可按照包括如下步驟的方法進行：將所述小麥幼胚用預培養培養基在25℃下暗培養12-24小時、如24小時；所述預培養培養基的基礎培養基可為MS培養基。

在上述方法中，所述農桿菌可為發根農桿菌，如發根農桿菌R1000。

在上述方法中，所述小麥幼胚為開花后13-15天的所述小麥幼胚。

在上述方法中，步驟1)所述將含有目的DNA的重組農桿菌接種于小麥幼胚，按照包括如下步驟的方法進行：將所述小麥幼胚浸泡于所述重組農桿菌的菌液中5～10分鐘，如5分鐘；所述重組農桿菌菌液的OD₆₀₀為0.5～0.6，如0.6。

在上述方法中，在所述浸泡期間用超聲波處理含有所述小麥幼胚的所述菌液20～30s，如20s，所述超聲波的頻率為27kHz、功率為80w。

在上述方法中，步驟1)所述共培養具體可按照包括如下步驟的方法進行：將步驟1)所述接種后的所述小麥幼胚用共培養培養基進行培養，為了防止所述接種后的所述小麥幼胚褐化，在所述共培養的培養基中可添加抗氧化劑，所述抗氧化劑具體可為二硫蘇糖醇；為了促進所述重組農桿菌的T-DNA與所述小麥的染色體整合，在所述共培養的培養基中還可添加乙酰丁香酮。