[發明專利]結核分枝桿菌耐藥突變基因檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201110458909.8
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102424859A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 何海華;李烈軍
• 申請（專利權）人: 廣東凱普生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因領域，具體是結核分枝桿菌（MTB）耐藥（利福平和異煙肼）突變基因檢測試劑盒。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)侵入人體后引起的一種具有強傳染性的慢性消耗性疾病，其發病率較高，危害性極大。WHO已將結核病作為重點控制的傳染病之一，并于1995年起將每年的3月24日定為“世界防治結核病日”，以提醒公眾加深對結核病的認識。

據WHO報道，全世界有2000萬結核病人，每年新增病例800萬之多，每年約有300萬人死于結核病，位居各類傳染病死亡人數之首。根據最新的衛生部調查顯示：我國有5.5億人感染過結核桿菌，目前有肺結核病人約450萬，其中傳染性肺結核病人約150萬，結核病患者數量居世界第二位。中國每年約有130萬新發病例，是全球22個結核病高負擔國家之一，每年因結核病死亡人數達13萬，大大超過其他傳染病死亡人數的總和。

近幾年由于抗生素類藥物的濫用和不合理的治療方案，加上結核桿菌的變異性較大，導致結核病多重耐藥株的出現和傳播，給臨床上治療結核病帶來極大的困擾。耐多藥結核病(MDR-TB?)是指耐異煙肼和利福平兩種或兩種以上抗結核藥物的結核分枝桿菌引起的結核病。1992年美國發生了多起耐多藥結核病的暴發流行，不僅耐藥菌傳播快，而且患者病情進展迅速，從診斷到死亡平均4～6周，死亡率高(37%)，而在人免疫缺陷病毒感染者中死亡率更高(72%～89%)?，已被稱為“第三種流行病”(第一種是AIDS，第二種是結核病)。MDR患者對大多數一線抗結核藥物耐藥，采用目前標準的結核化療方案治療無效，而傳統的藥敏試驗需1～2月時間，有些患者在藥敏結果出來前已死亡。耐藥菌不僅在AIDS?患者中播散，也傳染給醫護人員和其它AIDS?接觸者。我國的結核病疫情和耐藥情況也很嚴重。耐多藥結核患者所攜帶的結核分枝桿菌對健康人群的威脅比不耐藥的結核病患者更大，而在治療花費上，一般的結核病人的治療費用在每人150～200元，耐藥病人則需要每人1.5萬～2萬元。因此，耐藥結核既是嚴重的公共衛生問題，也是沉重的經濟問題。

在結核病治療和控制的初期必須依賴于準確檢測方法的實施，目前在臨床實驗室仍然用常規方法，即絕對濃度法、比例法和抗性比率法，但這些方法均以細菌生長為終點判斷結果，由于結核分枝桿菌生長緩慢，在得到分離培養物后仍需4～8周方能獲得結果，所以急需建立快速、準確、可靠的藥物敏感性試驗方法。近年來，隨著分子生物學理論和技術的發展，結核分枝桿菌的耐藥機制及耐藥的分子基礎大部分已被闡明，建立了快速檢測結核分枝桿菌耐藥基因的方法，為結核分枝桿菌快速藥物敏感性試驗開辟了一條新的途徑。

經研究發現，異煙肼的耐藥性50%-70%是由katG基因的315位點突變引起的，5%-10%是由inhA基因的突變引起的；利福平的耐藥性95%-99%以上是由編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變引起，突變均發生在rpoB?509～533位的25個氨基酸（75bp）組成的區域內，且臨床上多數耐利福平藥物的菌株也耐異煙肼。

雜交法能提升DNA分析的特異性，但是大多數雜交方法耗時耗力，無法達到臨床快速檢測的要求。將PCR檢測靈敏性高的特點配合特異性極高的反斑點雜交技術以一種簡單、快速且省錢的方式結合起來，利用導流雜交技術(美國專利5,741,647和6,020,187；中國專利02102795.1)可大大提高雜交的效率，且操作方便。因此，研制和開發一種可利用導流雜交技術快速、簡便、特異、敏感檢測3個耐藥基因（rpoB、katG、inhA）主要突變，提示對兩種一線抗結核藥物（利福平和異煙肼）耐藥性的檢測試劑和儀器具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述問題，提供一種結核分枝桿菌（MTB）耐藥（利福平和異煙肼）突變基因檢測試劑盒，包括：

（1）一個基因芯片，其上帶有：

（????????????????????????????????????????????????）結核分枝桿菌耐利福平和異煙肼的耐藥基因rpoB、katG和inhA的主要突變位點的核苷酸探針，其中探針為SEQ?ID?Nos：1-31或與SEQ?ID?Nos：1-31互補的序列，探針序列如下：

名稱??????????????????????????????????????序列??????????????????????????????????????序列號