[發明專利]用原核表達產物處理水稻根組織誘導其產生胼胝質的方法

無效

• 申請號: 201110458326.5
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102559575A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 楊靜;李成云;劉林;朱有勇;王凱;施竹鳳
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C07K14/37
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種用原核表達產物處理水稻根組織誘導其產生胼胝質的方法，具體涉及一種用稻瘟病菌效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織誘導其產生胼胝質的方法，屬于植物保護和生物技術領域。

背景技術：

植物與其病原菌共同進化了上百萬年，自然選擇促使植物產生了各種各樣的識別和抗性機制來防止和限制病原菌侵染。植物進化的同時也促使病原菌基因進化以適應或抵抗植物防御反應使其侵染寄主達到致病的最終目的。寄主-病原菌進化的結果使病原菌參與進化的基因多樣化，特別是編碼病原菌效應蛋白的基因。盡管效應蛋白被認為是對植物致病，但在一些植物品種里，效應蛋白也能被抗性蛋白識別，引發寄主細胞程序化死亡即HR反應。因此，病原菌效應蛋白具有誘導植物致病和防御反應的雙重作用。

稻瘟病菌效應蛋白基因PWL1、PWL2、AVR-Pita、ACE1、AVRs、AVR-Pia、AVR-Pii和AVR-Pik/km/kp已經被克隆鑒定，除PWL1、PWL2和ACE1外，其余效應蛋白基因均特異性地與相應抗性基因發生互作。在它們與水稻發生特異性非親和互作時能快速地引發寄主細胞HR反應。此外，對稻瘟病菌侵染早期的基因也研究得較多，諸如識別疏水信號的MPG1、PTH11基因，進行信號傳遞的CPKA，MAC1、MAGB，PMK1，MST7和MST11等基因，參與黑色素合成的ALB1、BUF1和RSY1基因，附著胞膨壓形成的PTH2基因，侵入栓形成的PLS1、MST12，MPS1、GAS1、PDE1、CYP1等基因。以上涉及到的稻瘟病菌效應蛋白基因大都是稻瘟病菌侵染過程中表達的基因，都是致病基因，也涉及引起寄主細胞HR反應的無毒基因。而很少涉及能夠引發水稻基本防御反應產生的效應蛋白基因的報道。我們從預測的分泌蛋白基因中，發現了一個表達產物能夠在水稻葉片上引起壞死斑的基因，通過RT-PCR檢測，表明其在稻瘟病菌侵染水稻24h時的表達量達到最高，其表達量變化特征表明該基因主要在侵染前期大量表達，能夠作為稻瘟病菌侵染前期引發寄主基本防御反應研究的候選基因。

目前，研究病原菌侵染初期引發寄主基本防御反應的方法主要涉及寄主細胞活性氧測定、基本防御反應相關基因表達譜分析和寄主葉片胼胝質產生觀察等方法。而對利用病原菌效應蛋白基因的原核表達產物純化后處理水稻根組織觀察胼胝質產生的方法很少見報道。而且觀察葉片產生胼胝質時容易受到葉片本身自發熒光的干擾，而植物根組織本身自發熒光較葉片少，對觀察根組織產生胼胝質的影響很小。現在還沒有一種直接利用基因的原核表達產物體外檢測稻瘟病菌效應蛋白誘導寄主根組織產生胼胝質，以快速鑒定效應蛋白基因是否引發寄主基本防御反應的方法的報道。

發明內容：

本發明的目的是克服現有技術之不足，而提供一種快速、簡便、準確的用稻瘟病菌效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織誘導其產生胼胝質的方法。

本發明的技術方案是：保持現有原核表達產物表達純化及胼胝質觀察方法不變，包括原核表達技術、蛋白純化技術、所用熒光顯微鏡的激發光和發射光波長范圍、苯胺藍染色方法均與常規相同，其特征是用稻瘟病菌效應蛋白基因的原核表達產物，按照1.0mg/ml～10.0mg/ml濃度處理抗病水稻品種日本晴根組織12h后苯胺藍染色，熒光顯微鏡直接觀察胼胝質形成。

本發明的有益效果在于：

1、方法簡便、準確、快速。

2、利用純化的效應蛋白基因的原核表達產物處理水稻根組織，通過熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質產生，能直接定性地獲得水稻基本防御反應產生的情況。

3、苯胺藍直接對水稻根進行染色，且熒光顯微鏡觀察根組織胼胝質形成時能有效地避免較多自發熒光干擾。

具體實施方案：

實施例一：

1.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織12h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質形成情況。

將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4℃離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM?Tris-HCl，pH7.4；200mM?NaCl；1mM?EDTA；10mM?β-巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照1.0mg/ml的濃度處理抗病水稻品種日本晴的根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質觀察。對照是將該基因的原核表達產物純化后按照1.0mg/ml的濃度處理感病水稻品種麗江新團黑谷根組織12h，苯胺藍直接染色進行胼胝質觀察。結果見表1。