[發明專利]一種快速檢測杜冷丁的膠體金檢測試劑盒及其制備

有效

• 申請號: 201110458002.1
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102520181A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 張國華
• 申請（專利權）人: 上海凱創生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 上海光華專利事務所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

技術領域

本發明涉及一種膠體金檢測試劑盒以及制備工藝，具體涉及杜冷丁膠體金檢測試劑盒以及制備工藝。

背景技術

杜冷丁的學名叫哌替啶，又叫作嘜啶、地美露，是人工合成的嗎啡代用品，其鹽酸鹽為白色結晶狀粉末，能溶于水和乙醇，一般制成針劑，主要用于疼痛、心源性哮喘、內臟絞痛等適應癥。杜冷丁對人體的作用機理與嗎啡相似，欣快、鎮痛作用較嗎啡小，但連續使用1-2周便可產生依賴，一旦停止后則會產生相似于嗎啡戒斷后的戒斷綜合癥，主要表現為精神萎靡不振、全身不適、流淚流涕、嘔吐、腹瀉、失眠，嚴重者也會產生虛脫。杜冷丁的濫用是我國當前所面臨的毒品問題之一，已被列入國家麻醉藥品予以嚴格管制。

目前，杜冷丁的檢測方法中運用最廣泛的主要是氣相色譜GC、高效液相色譜HPLC、氣相質譜GC/MS或GC/FID分析的方法，這些檢測方法需要專業人員操作，且復雜費時，成本高，僅適用于杜冷丁的確認檢測，卻不能達到國內緝毒、查毒、禁毒行動所需的方便、快速、靈敏的要求。至今，國內尚沒有涉及杜冷丁快速檢測試劑的相關專利。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，從提高檢測靈敏度出發，提供一種既方便又快速的杜冷丁膠體金快速檢測試劑盒及其制備方法。

本發明的一方面，提供一種杜冷丁膠體金檢測試劑盒，包括試劑條，試劑條從加樣端開始依次為濾樣紙、免疫膠體金紙片、免疫硝酸纖維素膜和吸水紙，其中，所述免疫膠體金紙片為包被有膠體金標記的抗杜冷丁單克隆抗體的玻璃纖維墊片，免疫硝酸纖維素膜設有檢測線(T線)和質控線(C線)，檢測線上噴點有杜冷丁-載體復合物，質控線上噴點有羊抗鼠IgG。

較佳的，所述膠體金標記的抗杜冷丁單克隆抗體中，膠體金為粒徑39-42nm的球形顆粒。

本發明的第二方面還提供了上述杜冷丁膠體金檢測試劑盒的制備方法，包括下列步驟：

1)用兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金；

2)采用步驟1制得的膠體金標記抗杜冷丁單克隆抗體獲得免疫膠體金；

3)采用噴金緩沖液稀釋步驟2)的免疫膠體金獲得免疫膠體金溶液，用免疫膠體金溶液噴涂經預處理的玻璃纖維墊片，制得免疫膠體金紙片；

4)在硝酸纖維素膜的檢測線和質控線上分別噴點杜冷丁-載體復合物及羊抗鼠IgG，制得免疫硝酸纖維素膜；

5)將濾樣紙、步驟3制備的免疫膠體金紙片、步驟4制備的免疫硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在膠板上，切裁制得檢測試劑條；最后將檢測試劑條裝入塑料盒制得檢測試劑盒。

步驟1)所述兩步還原法制備平均粒徑為39-42nm的膠體金具體包括下列步驟：

a)第一次還原氯金酸溶液：

制備濃度為0.0004-0.0005mol/L的HAuCl₄水溶液，加熱煮沸20-30分鐘，之后邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉水溶液，HAuCl₄與檸檬酸三鈉的摩爾比為1∶(8-9)，超聲振蕩2-3分鐘后冷卻至室溫，既制得14～16nm粒徑的膠體金原溶液。

b)第二次還原氯金酸溶液：

將第一步制得的膠體金原溶液放置于4.0-4.5℃恒溫冰浴中穩定溫度，隨后按膠體金原溶液與HAuCl₄水溶液體積比1∶(1.9-2.0)加入4.0-4.5℃的0.003-0.004mol/L?HAuCl₄水溶液，隨后立即邊攪拌邊滴加4.0-4.5℃的抗壞血酸與PVP(聚乙烯醇吡咯烷酮)的混合水溶液，加入的抗壞血酸與本步驟加入的HAuCl₄的摩爾比為(25-26)∶1，加入的PVP與本步驟加入的HAuCl₄的重量比為1∶(2.0-2.1)，反應中保持溫度恒定，攪拌至反應完全，溶液呈透明的酒紅色，既制得39-42nm粒徑的膠體金溶液。

兩步還原法中，配置各種水溶液均采用雙蒸水。

步驟a)中，加入檸檬酸三鈉水溶液的濃度為0.01-0.02mol/L。

步驟a)中，超聲震蕩的頻率為20-30KHZ。

步驟b)中，抗壞血酸與PVP的混合水溶液的滴加速度為1-2滴/s。

步驟b)中，所述抗壞血酸與PVP的混合雙蒸水水溶液中，抗壞血酸的濃度為0.017-0.019mol/L，PVP的濃度為0.137-0.139g/L。

步驟b)中，攪拌反應約為50-70分鐘。

采用上述方法制得的膠體金清亮透明，粒徑尺寸均一，無凝集顆粒，基本未發現非球形粒子。