[發明專利]一種來源于人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結的細胞株及其制備方法

有效

• 申請號: 201110457302.8
• 申請日: 2011-12-31
• 公開（公告）號: CN102517254A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 何建行;李慧靈
• 申請（專利權）人: 廣州呼吸疾病研究所;何建行;李慧靈
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12R1/91
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及一種來源于人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株及其制備方法。

背景技術

腫瘤是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，世界衛生組織發表的一項研究報告表明，全球癌癥狀況將日益嚴重，因此，深入研究腫瘤發生、發展和轉移的分子機制，尋找更為有效的腫瘤治療方案，成為當今醫學研究的前沿課題。隨著腫瘤生物學研究的不斷深入，腫瘤的早期診斷及預防水平有了較大的提高，但是腫瘤治療后的高轉移及高復發仍是腫瘤臨床治療中一個亟待解決的難題。近年來，“腫瘤干細胞”學說的提出及其研究進展，從一個全新的角度去認識腫瘤。該學說認為，腫瘤中存在一部分獨特的具有自我更新和分化功能的干細胞樣亞群并將之稱為腫瘤干細胞，這一亞群細胞正是腫瘤的起源細胞并維持腫瘤的生長。因此，腫瘤細胞株是研究細胞癌變機理、腫瘤轉移、腫瘤放療和化療敏感性分子基礎等生物醫學問題的重要材料，建立和鑒定不同的腫瘤細胞株是一項很有意義的工作。

發明內容

本發明的目的是提供一種來源于人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，所述細胞株具有典型的腫瘤細胞生物學特性；同時，還提供一種所述細胞株的制備方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種來源于人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株，命名為人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym，保藏號為CCTCC?NO：C201033。

所述細胞株在倒置顯微鏡下觀察顯示，細胞體積小，核大，胞漿少，細胞與平皿之間貼附生長，貼附不緊密，細胞可成團半懸浮生長。

所述細胞株的體外倍增時間為31.225h。

所述細胞株的蛋白表達特征為NSE陽性表達。

本發明所述人小細胞肺癌肺門淋巴結轉移灶來源細胞株0225-12ScacLym，是一株來源于中國南方人肺小細胞癌淋巴結轉移灶的細胞株，原始肺癌組織來源于一位54歲男性肺癌病人的左肺門腫瘤病灶，病人在手術前一年接收了放療和化療，藥物療程和射線劑量如下：VP12+DDP?2療程，放療56gy（28天），紫杉醇+DDP?3療程，肺門和縱隔淋巴結變小。手術前3個月又出現肺門腫物增大，痰中找到腫瘤細胞，即行拓撲替康+DDP?3療程，肺門腫物見縮小后即實行手術。淋巴結轉移癌組織經NOD-SCID鼠體內生長形成移植瘤后再體外培養成功細胞株。

一種來源于人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶的細胞株的制備方法，包括以下步驟：

（1）組織塊機械解離：將切除的人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離，清洗去除雜質，分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩余的組織；

（2）膠原酶消化：將步驟（1）得到的剩余的組織清洗，然后加入膠原酶，孵育，過濾，然后收集腫瘤細胞，進行接種培養，得到存活細胞；

（3）對步驟（2）得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質，純化后的肺癌細胞連續培養并傳代大于12個月，即得細胞株。

作為本發明所述制備方法的優選實施方式，所述制備方法包括以下步驟：

（1）組織塊機械解離：將切除的人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離，清洗去除粘液和紅細胞等雜質，分離肺癌實質組織，去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織，得到剩余的組織；

（2）膠原酶消化：將步驟（1）得到的剩余的組織切成1mm³的組織片，清洗組織片，讓組織片沉淀，去除上清液，把剩余組織再細切，清洗組織碎片，然后向組織片加入膠原酶，在37℃下孵育4-18小時；過濾，然后收集腫瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中懸浮細胞，進行接種培養，得到存活細胞；

（3）對步驟（2）得到的存活細胞進行純化，去除纖維細胞等雜質，純化后的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基中連續培養并傳代大于12個月，即得細胞株。

作為本發明所述制備方法的優選實施方式，所述步驟（1）為：將切除的人放化療后復發小細胞肺癌淋巴結轉移灶組織解離成0.5cm³，用100%的青-鏈霉素雙抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS緩沖液反復清洗組織去除粘液和紅細胞等雜質，再浸泡于培養基中移至解剖顯微鏡下，用兩個10號注射器針頭分離肺癌實質組織，并去除正常肺泡及支氣管組織和間質組織后，得到剩余的組織。