[發明專利]一種在恒溫熱源下進行聚合酶鏈式反應的方法及裝置

無效

• 申請號: 201110456811.9
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN103173434A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 葛勝祥;周文彬;張師音;陳清瑞;夏寧邵
• 申請（專利權）人: 廈門萬泰滄海生物技術有限公司;廈門大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12M1/00;C12M1/38;C12M1/34;C12Q1/68
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明涉及一種聚合酶鏈反應方法及裝置。更具體地，本發明涉及基于熱對流建立液體自下而上的溫度梯度的原理，在液體受熱自發進行對流，并在流經不同溫度區域時發生相應PCR擴增的方法，以及相應的裝置。

背景技術：

聚合酶鏈反應技術(以下簡稱PCR技術)，是一種體外快速擴增DNA的技術，每個循環包括變性、退火和延伸三個過程，每經過一個循環，目的核酸分子的數目擴增一倍，經過30-40個循環，目的核酸分子數目擴增到原來的近10⁹倍，PCR是體外大量獲得目的DNA片段的方法，便于對核酸分子做進一步的分析和檢驗。目前，PCR技術已廣泛地應用于基礎研究和應用研究。PCR作為一個“無細胞基因擴增系統”，在基礎研究中可用于克隆基因，并在此基礎上對基因組DNA進行直接序列分析，檢測突變位點，分析染色體重組等。在應用研究中，則可以用于傳染病的診斷、遺傳疾病的檢測及產前診斷、法醫研究等。美國專利4,683,202；4,683,159；4,800,159；4,965,188號對PCR技術做出了描述。

DNA的擴增在體內是由細胞內有關因子的參與下，雙螺旋的DNA分子被解鏈成2條單鏈，在引物酶的作用下合成DNA引物，引物與單鏈DNA堿基互補配對，形成引物單鏈DNA復合物；在DNA聚合酶作用下，沿著5’-3’方向，按堿基互補配對原則，在引物3’端開始，逐一將互補的三磷酸脫氧核苷酸接上，最終形成一條新的雙鏈DNA分子。

而DNA分子在體外的PCR擴增模擬了體內的三個步驟：首先，在大約95℃的高溫下加熱雙鏈DNA樣品，雙鏈間的氫鍵會斷裂，使得DNA熱分解成兩條互補的單鏈DNA分子，這一過程稱為高溫解鏈反應；然后，溫度迅速降到大約50-65℃的范圍內，在這個溫度下單鏈DNA與引物按堿基互補配對原則結合，這一過程稱為低溫退火反應；退火反應結束后，溫度要迅速升高到72℃左右進行延伸反應，在DNA聚合酶以及適當鎂離子濃度的條件下，從引物的3’端開始結合單核苷酸，從而形成一條新的DNA。經過一個這樣的過程，原來的一個DNA雙鏈分子就形成了兩個DNA分子，增加了一倍。反復進行高溫解鏈-低溫退火-中溫延伸三個過程，就可以獲得數量更多的復制雙鏈，并且這些新形成的雙鏈又可以作為下次循環的模板。

目前，主流的PCR擴增技術的反應裝置一般以溫控金屬塊加熱塑料制成的PCR反應管，通過金屬塊的加熱、冷卻，達到平衡溫度后將熱通過反應管傳遞至PCR反應液。這種裝置的缺陷是：反應體積較大，即系統通常具有較大的體積和熱容，常規PCR完成30個循環一般需要2-3小時，其中大部分時間消耗于加熱和冷卻過程，即將金屬塊達到平衡溫度并將熱通過反應管傳遞至PCR反應液，因此，PCR難以實現高效和高通量。而為了加快升降溫的速度，也使得PCR儀器制造的困難加大，儀器成本大幅度提高。

在此基礎上，20世紀九十年代，研究者們開始將微流控芯片技術應用于PCR擴增。微流控芯片技術是近十年來迅速發展起來的一種新的微型分析系統，它采用微加工技術在厘米尺寸的玻璃、塑料及硅橡膠材料上蝕刻出微米尺寸的反應管道及分析組件，由于各種分析過程可在微米尺寸的結構中完成，一方面可使珍貴的生物試樣與試劑消耗降低到微升生至納升級，另一方面使分析速度成十倍、百倍的提高，實現高通量的檢測。PCR裝置的微型化不僅降低了PCR樣品的消耗量，而且較低的熱容量顯著提高了系統的熱傳導效率，使PCR反應速度大大加快。目前，PCR微流控芯片系統主要有兩種形式：微室靜態型PCR芯片和連續流動型PCR芯片。前者是傳統PCR的微型化，即將反應混合物固定在反應池中，依賴于溫度控制裝置的溫度循環變化進行熱循環擴增，由于是傳統PCR的微型化，體積和熱容減少，因此反應時間大大減少，能量消耗也大幅度的降低；而后者通過微加工形成逶迤形流路，在一定推動力的作用下，使PCR反應液連續流經三個不同的溫區，完成變性、退火和延伸過程，其優點是其反應溫度無需來回反復地快速升降。雖然這兩種PCR微流控芯片系統能夠快速、高效擴增目的DNA片段，并已成功的實現了與毛細管電泳分離，實時熒光檢測以及數組芯片雜交等過程的集成化。但前者其實只是傳統PCR的微型化，仍沒有突破依靠加熱、冷卻模塊來反復升降溫的模式，沒有徹底解決升降溫的耗時長問題；而后者雖然解決了反復升降溫的耗時問題，卻帶來新的問題，即系統通常包含復雜的液體驅動系統，一方面增加了儀器及反應容器制作的復雜性和成本，另一方面操作比較復雜，限制了其廣泛應用。