[發明專利]一種Taqman水解探針以及定量檢測MGMT甲基化程度的方法

有效

• 申請號: 201110455660.5
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102424857A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 戴鵬高;周慧敏;王浩;劉端;陳超
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 徐平

1.一種Taqman熒光水解探針，其特征在于：該Taqman熒光水解探針的基本序列為GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列與基因組DNA序列互補區向上游延伸不超過5nt，下游延伸不超過5nt。

2.一種利用如權利要求1所述的Taqman熒光水解探針定量檢測MGMT甲基化程度的方法，包括以下步驟：

(1)制備PCR反應模板

用亞硫酸氫鹽對樣品基因組DNA進行甲基化轉化處理；

(2)配置反應體系

向一支PCR反應管中依次加入下列組份：

10×PCR緩沖液??2ul；

四種dNTP(三磷酸脫氧核苷酸)混合物??各200umol/L；

甲基化上游引物??10～100pmol；

甲基化下游引物??10～100pmol；

亞硫酸鹽處理后模板DNA??25～50ng；

熱啟動DNA聚合酶??2.5u；

加雙蒸水至20ul；

向另一支PCR反應管中依次加入下列組份：

10×PCR緩沖液??2ul；

四種dNTP(三磷酸脫氧核苷酸)混合物??各200umol/L；

非甲基化上游引物??10～100pmol；

非甲基化下游引物??10～100pmol；

亞硫酸鹽處理后模板DNA??25～50ng；

熱啟動DNA聚合酶??2.5u；

加雙蒸水至20ul；

(3)將反應體系置于熒光PCR反應儀中，按照以下程序進行反應；

PCR反應程序：

95℃?10min；

72℃?2min；

(4)通過熒光PCR儀配套軟件獲取分別對應于兩支PCR反應管的甲基化反應的Ct值和非甲基化反應的Ct值；

(5)按照以下計算式

甲基化百分含量＝100/[1+2(Ct^CG-CT^TG)]％

計算得到MGMT甲基化程度。