[發明專利]一種可同時沉默NKG2D的多種配體的RNA干擾載體，及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201110454080.4
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102505022A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 田志剛;黃玫;孫汭;魏海明
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/113;C12N15/861;C12N15/66;C12N7/01;A61K48/00;A61P1/16
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

1.NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其中在載體中含有至少一種配體分子的小干擾RNA結構單元以及任選地陰性對照shRNA寡核苷酸編碼序列。

2.權利要求1所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其中所述在載體中包含二種配體分子或三種配體分子的小干擾RNA結構單元。

3.權利要求1或2所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其中所述配體為Rae1，Mult1或H60。

4.權利要求3中所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其中針對Rae1的小干擾RNA序列為SEQ?ID?NO：1-3的序列；針對Mult1的小干擾RNA序列為SEQ?ID?NO：4-6的序列；針對H60的小干擾RNA序列為SEQ?ID?NO：7-9的序列。

5.權利要求1-4中任一項所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其中所述的載體是腺病毒穿梭載體或者腺病毒載體。

6.根據前述權利要求中任一項所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，所述小干擾RNA結構單元含有相應分子的發夾結構小干擾RNA的DNA序列、位于該DNA序列上游的H1.1啟動子和位于該DNA序列下游的TTTTTT終止子。

7.根據權利要求6所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統，其特征在于所述的載體所含的發夾結構小干擾RNA的DNA序列由位于中間的莖環序列和分別位于該莖環序列兩側的有義鏈和與該有義鏈互補的反義鏈構成。

8.權利要求1-7中任一項所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體用于制備預防和/或治療肝炎的藥物的應用。

9.權利要求1-8中任一項所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統的構建方法，所述方法包括以下步驟：

A.在腺病毒穿梭質粒中，分別插入Rae1，Mult1，H60的小干擾RNA結構單元以及陰性對照shRNA寡核苷酸編碼序列，構建NKG2D單配體RNA干擾載體；

B.設計帶酶切粘端的引物，從上述A步驟所構建的單配體RNA干擾載體上分別擴增其shRNA轉錄單位，包括上游啟動子，編碼發夾結構小干擾RNA的DNA序列、下游終止子；其中shRNA1的下游引物所引入的酶切位點與shRNA2的上游引物所引入的酶切位點為同一種限制性內切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位點與shRNA3的上游引物所引入的酶切位點為同一種限制性內切酶，如此順序下去；

C.通過PCR的方法，用以上引物分別擴增得到大量的各配體分子的shRNA轉錄單位，用相應的限制性內切酶對PCR產物進行切割并回收，進一步用DNA連接酶將酶切后的shRNA轉錄單位的PCR產物首尾相連，得到NKG2D多配體shRNA轉錄單位大片段；

D.用限制性酶切酶酶切消化C步驟所得到的NKG2D多配體shRNA轉錄單位大片段，與同樣酶切線性化的腺病毒穿梭質粒連接，構建NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體。

10.權利要求9所述的NKG2D多配體RNA干擾單一載體表達系統的構建方法，其中進一步包括下述步驟；

E.用歸巢核酸內切酶雙酶切D步驟所得到的NKG2D多配體RNA干擾腺病毒穿梭載體，回收包括NKG2D多配體shRNA轉錄單位大片段在內的片段；

F.用相同的歸巢核酸內切酶雙酶切復制缺陷型重組腺病毒載體，回收腺病毒骨架片段；

G.進一步用DNA連接酶將A步驟和B步驟所得到的回收片段連接起來，得到NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體；

H.線性化NKG2D多配體RNA干擾重組腺病毒載體，并轉染進適合的宿主細胞，在其中包裝成具有復制能力的完整腺病毒顆粒。