[發明專利]一種過量表達PBD-2基因的轉基因豬的培育方法

無效

• 申請號: 201110453326.6
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102517329A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 周銳;楊希
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/873;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種用于過量表達豬PBD-2基因的轉基因豬的培育方法，其步驟是：

①pcDNA3.1(+)/pCA-PBD2載體構建與線性化：設計一對引物，提取豬肝臟組織RNA，RT-PCR擴增獲得PBD-2基因，通過EcoRI和XhoI將獲得的片段連接到真核表達載體pCA中，獲得載體pCA-PBD2，通過SspI和XhoI雙酶切pCA-PBD2和pCDNA3.1(+)，通過連接酶連接得到pcDNA3.1(+)/pCA-PBD2，載體質粒大提后用AccI進行線性化處理，分離純化得到線性表達盒片段，大小4189bp；

②脂質體轉染及細胞篩選：為了構建穩定過量表達PBD-2的豬成纖維細胞，按照脂質體Lipofectamine^TM?2000說明書進行轉染上述制備的豬成纖維細胞，5％CO₂，37℃培養；

轉染PBD-2基因后，將核供體細胞培養2-4天，利用600μg/ml?G418連續篩選8天后，獲得抗性單克隆細胞并擴大培養，通過PCR和RT-PCR方法對獲得細胞進行鑒定，得到過量表達PBD-2的轉基因豬成纖維細胞，用于后續手工核移植制備重組囊胚；

③手工核移植方法獲取重組囊胚：

a.受體細胞的準備：制備受體細胞，從屠宰場收集豬的卵巢放置入生理鹽水的容器內運輸至實驗室，將卵巢表面的卵泡戳破，使卵泡內的卵母細胞和卵泡液一起流出，用預熱至38.5℃的洗卵液2％v/v血清洗滌卵泡，在顯微鏡下挑選顆粒細胞層多且致密，胞質均勻的卵母細胞，收集卵泡液中所有的卵母細胞，所得卵母細胞以40-50個為一個孔，移至在5％CO₂培養箱平衡6小時，內置400μL卵母細胞體外培養液：TCM-199(1X)80％v/v，hCG?15IU/mL，PMSG?10IU/mL，谷氨酰胺0.10mg/mL，慶大霉素0.05mg/mL，豬卵泡液10％，血清10％的四孔板中，38.5℃，5％CO₂成熟36小時，用于克隆操作；

b.去核以及核供體細胞的注射：用5.0μg/mL柔紅菌素作為去核試劑，處理體外培養成熟的豬卵母細胞10小時，滅活卵母細胞，將成熟后的卵母細胞-卵丘復合體，用透明質酸酶消化卵丘細胞形成裸卵，進行顯微操作，將裸卵放入顯微操作盤操作滴中，用固定吸液管從極體對側固定卵母細胞，用外徑20～25μm的尖的去核管吸取1μL細胞質，吸取供核細胞，再將細胞質和供體細胞一起注入卵母細胞的卵周隙中，產生核移植胚胎；

④胚胎移植：將培育好的囊胚移入代孕母豬的輸卵管中，平均每頭移植98個融合細胞，共移植4頭母豬，胚胎移植4周后用超聲波對母豬的妊娠情況進行第一次檢測評價，以后每隔一周進行一次超聲波檢測儀監控受孕母豬的妊娠情況和胎豬的生長情況，共檢測6次；

⑤轉基因豬的鑒定：小豬生產后飼養至斷奶后取其耳部組織，通過提取轉基因豬基因組DNA進行PCR鑒定和提取轉基因豬RNA進行RT-PCR擴增相結合來對轉基因陽性豬進行鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種用于過量表達豬PBD-2基因的轉基因豬的培育方法，其特征在于：所述的提取轉基因豬基因組DNA進行PCR鑒定，是通過NP03/NP04引物引物擴增：NP03：5′-GCTGGTTGTTGTGCTGTCTC-3′，NP04：5′-AGGTCCCTTCAATCCTGTTG-3′，擴增產物在1.5％g/v瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測；所述的提取轉基因豬RNA進行RT-PCR擴增，是提取RNA后先反轉錄為cDNA后，用NP03/NP04引物進行擴增，擴增產物在15％g/v瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。