[發(fā)明專利]從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110452722.7
• 申請(qǐng)日: 2011-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN102424812A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王偉東;溫雪;王彥杰;劉權(quán);晏磊;高亞梅;王艷霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/22
• 分類號(hào): C12N1/22;C12N1/20
• 代理公司: 大慶市建華專利事務(wù)所 23119
• 代理人: 常瑛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是微生物領(lǐng)域中的菌種分離方法，具體的是一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法。

背景技術(shù)

目前人們可分離培養(yǎng)的微生物只占世界上微生物總量的1%左右，還有99%的微生物目前沒(méi)有分離得到純培養(yǎng)菌株。對(duì)于好氧菌的純培養(yǎng)的分離與純化技術(shù)自1880年Koch發(fā)明的平板分離法以來(lái)已有130多年的歷史了，稀釋平板涂布法、稀釋混合平板法、平板劃線法、顯微操作器單細(xì)胞挑取法都是常規(guī)的分離和純化微生物的方法。前三種方法不需要特殊昂貴的儀器設(shè)備，極易操作，一般情況下都能順利進(jìn)行，達(dá)到好的效果。

對(duì)于厭氧微生物的分離與培養(yǎng)有著特殊性，主要是采取各種方法使他們處于沒(méi)有氧的環(huán)境或氧化還原點(diǎn)位低的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于厭氧要求相對(duì)較低的一般厭氧菌的培養(yǎng)主要有：堿性焦性沒(méi)食子酸法、庖肉培養(yǎng)基法，這兩種方法是最常用的厭氧培養(yǎng)技術(shù)，雖然兩種方法無(wú)需特殊昂貴的設(shè)備操作簡(jiǎn)單，適用于任何可密封的容器，可迅速建立厭氧環(huán)境，但其缺點(diǎn)是在氧化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生少量的有毒氣體，會(huì)抑制某些厭氧菌的生活，其中庖肉培養(yǎng)基法多應(yīng)用于厭氧的芽孢菌的分離與保存中。對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌的分離和培養(yǎng)主要有：Hungate滾管技術(shù)、厭氧罐法、厭氧手套操作培養(yǎng)箱，以上方法操作復(fù)雜對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的要求也比較高并且試驗(yàn)成本很高，但也有其自身的優(yōu)點(diǎn)，就是可以保證環(huán)境的絕對(duì)厭氧，也不會(huì)產(chǎn)生任何有毒的物質(zhì)而抑制微生物的生長(zhǎng)。

纖維素分解復(fù)合菌系是一組以高溫期堆肥為原料富集獲得的具有高效穩(wěn)定分解纖維素能力的細(xì)菌復(fù)合群體（一組木質(zhì)纖維素分解菌復(fù)合系的篩選及培養(yǎng)條件對(duì)分解活性的影響，王偉東、崔宗均、牛俊玲、樸哲、劉建斌，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，9（5）：7～11，2004），為了研究其微生物組成，篩選出分解能力更強(qiáng)的菌株，需要將復(fù)合菌系進(jìn)行分離，分離出具有分解纖維素功能的單菌。但是在現(xiàn)有研究中，得到具有分解纖維素功能的單菌比較困難，因?yàn)槔w維素分解復(fù)合菌系中具有分解纖維素功能的菌株通常為厭氧菌，并且在分離的過(guò)程中需要隨時(shí)觀察降解纖維素的能力，以上提到的幾種厭氧菌分離方法均不適宜。分解纖維素的厭氧菌的分離關(guān)鍵點(diǎn)在于：1、單菌的分離；2、單菌功能的隨時(shí)檢測(cè)。目前一般采用Hungate厭氧管技術(shù)，Hungate厭氧管能隨時(shí)觀察纖維素降解的情況，但不便進(jìn)行單菌分離操作，易染菌，因?yàn)镠ungate厭氧管體比較長(zhǎng)，即便產(chǎn)生了單個(gè)菌落，菌落在挑出時(shí)難度也比較大，容易碰倒其他菌落、挑出時(shí)極易與管壁接觸，造成挑出的單菌不純，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而厭氧罐不便隨時(shí)觀察菌種降解纖維素情況。因此，需要發(fā)明一種能夠適合分解纖維素的厭氧菌的分離方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題提供一種從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，解決目前Hungate厭氧管挑出菌落困難，容易染菌，造成菌落不純以及厭氧罐法無(wú)法隨時(shí)觀察菌種降解纖維素情況的問(wèn)題。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：從纖維素分解復(fù)合菌系中分離分解纖維素的厭氧菌的方法，包括以下步驟：

A、將纖維素分解復(fù)合菌系用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50℃培養(yǎng)5～8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%～2%；

B、取出菌液用磷酸緩沖液（以下簡(jiǎn)稱PBS）按照1:10000～1000000的體積比進(jìn)行稀釋；

C、稀釋后的菌液用平板培養(yǎng)，平板為添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0.5%～1%，在50℃培養(yǎng)5～8天；?

D、挑取單個(gè)菌落用添加有濾紙的厭氧菌液體培養(yǎng)基在50℃培養(yǎng)5～8天，濾紙占厭氧菌液體培養(yǎng)基重量的1%～2%；?

E、取能夠降解濾紙的菌液，用添加有纖維二糖的厭氧菌固體培養(yǎng)基在50℃培養(yǎng)5～8天，纖維二糖占厭氧菌固體培養(yǎng)基重量的0.5%～1%；

所述的A、D、E步驟在Hungate厭氧管中進(jìn)行，C步驟在厭氧罐中進(jìn)行。

重復(fù)D、E步驟3～4次。

所述的濾紙被秸稈取代。