[發明專利]大豆中抗SMV蛋白及其編碼基因Rsv3C與應用

無效

• 申請號: 201110452700.0
• 申請日: 2011-12-30
• 公開（公告）號: CN102584967A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 王斌;陳建群;程浩;喻德躍;馮雪影
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/82;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及大豆中抗SMV蛋白及其編碼基因Rsv3C與它們在培育抗SMV大豆中的應用。

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背景技術

大豆是重要的植物蛋白質和食用油脂來源，但由大豆花葉病毒（Soybean?Mosaic?Virus,?SMV）所引起的大豆花葉病是在全世界范圍內普遍發生的最嚴重的大豆病害之一。在我國的各個大豆產區，每年SMV均造成相當程度的危害，且隨著病毒毒性的演變加強，產量損失有逐年加重的趨勢。例如從臺灣“亞蔬”引進的菜用大豆品種“臺灣75”就曾因為嚴重感染大豆花葉病毒在江浙兩省的許多地區幾乎絕產。SMV不僅降低大豆產量，而且造成籽粒斑駁，影響大豆的外觀品質，直接威脅到豆農增收和國家的農業安全。無論在國內還是國外，防治大豆花葉病一直是保障大豆持續生產的一個優先研究課題，但目前尚無有效藥劑用于SMV的防治。分子生物學技術的迅速發展，使得從大豆抗性品種中篩選出感性品種所不具備的功能性抗病基因，繼而利用其進行大豆分子育種成為可能。這是一種極佳的病毒防治策略，也是培育抗病、優質大豆新品種的最為經濟有效的辦法。

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發明內容

解決的技術問題：本發明針對上述技術空白，提供一種大豆中抗SMV蛋白及其編碼基因Rsv3C，并提供了它們在培育抗SMV大豆中的應用。

技術方案：

大豆中抗SMV蛋白，該蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.?1所述。

編碼上述大豆中抗SMV蛋白的基因Rsv3C，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?2所述。

包含上述核苷酸序列的重組質粒。

包含上述重組質粒的宿主載體。

上述的氨基酸序列在培育抗SMV大豆中的應用。

上述的核苷酸序列在培育抗SMV大豆中的應用。

有益效果：

本發明克隆的Rsv3C功能性抗SMV基因，可作為目的基因導入更多高產大豆品種，它所編碼的R蛋白能夠識別相應SMV病原釋放的效應因子并激發抗性反應，提高植物的抗病能力，達到植物品種改良的目的。

攜帶有本發明Rsv3C功能抗SMV基因的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、DNA直接轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。提高育種的準確性和加速育種進程，滿足生產上對品種抗性的要求，控制SMV的危害，提高大豆的產量和品質，增強國產大豆的市場競爭力。另外，通過對大豆抗SMV功能基因的快速預測、篩選、確定及克隆的研究，也可以為其它的抗病基因研究提供一種新的技術與操作平臺，推動大豆功能基因克隆新技術的發展。

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附圖說明??

圖1為大豆14號染色體上位于分子標記A519與M3Satt之間的5個NBS-LRR型抗病基因所在位置示意圖，分別命名為Rsv3-A,?B,?C,?D,?E；

圖2為針對每個基因的上下游特異區域設計引物，用于擴增相應基因的全部編碼區（包括一個內含子區域）；

圖3為從抗、感品種大豆中得到Rsv3上各基因的序列后進行分析，構建系統演化樹，發現只有Rsv3C基因在抗感品種間分別各自聚類，且抗性品種的序列發生很大變化，檢測到明顯的正向選擇作用，其演化模式符合功能性基因的特征；而其他的基因則不具備這些特征，如Rsv3B基因未能在抗感品種間各自聚類，序列差異不大，也檢測不到正向選擇作用；

圖4為蛋白質3D結構模擬分析顯示，上圖為感性品種，下圖為抗性品種：與感性品種中的Rsv3C相比，抗性品種早熟18中的Rsv3C產物在C-末端的功能識別區（LRR區域）發生了顯著變化，如感性蛋白中的一些松散的loop區域（箭頭）在抗性蛋白產物中不明顯，甚至消失。從而識別SMV病毒釋放的病毒因子，并激發抗性。

圖5為我們選用的轉基因克隆載體pBA002，將抗性品種早熟18中分離的Rsv3C基因已經連接到該載體中，質粒抽提的結果與PCR驗證結果均為陽性。圖中M1為15kb分子標記；1為連接成功后抽提的質粒（含有Rsv3C）基因；2為PCR驗證得到的Rsv3C片段；M2為8kb分子標記。

圖6為利用農桿菌介導的子葉節法，將早熟18-Rsv3C基因導入到高感品種后產生的轉基因植株，其葉片對大豆花葉病毒表現為抗性。

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具體實施方式

下面通過實施例更詳細的說明本發明，但本發明不受以下實施例的限制。

實施例1：

獲取功能基因：