[發明專利]一種量子點熒光免疫層析高靈敏定量檢測的方法

有效

• 申請號: 201110452439.4
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102520165A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 王東
• 申請（專利權）人: 北京康美天鴻生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發明涉及一種以優選材料為基礎，利用熒光量子點標記配體實現分析物定量檢測的方法，特別公開了一種高靈敏量子點熒光免疫層析方法，可實現病原體、重大疾病(如腫瘤、心血管疾病)、違禁藥品、毒品檢測、食品安全等多種分析物的半定量與定量檢測，屬于熒光免疫檢測技術領域。

背景技術

免疫層析(immunochromatography)是近十年來興起的一種快速診斷技術，以雙抗體夾心法為例，其原理是將特異的抗體先固定于層析膜(如硝酸纖維素膜)的某一區帶，當該干燥的層析膜一端滴加樣本(尿液或血清)后，由于毛細作用，樣本將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區域時，樣本中相應的抗原即與該抗體發生特異性結合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現特異性的免疫診斷。

免疫層析試紙條具有精確、快速和操作簡單等優點。膠體金免疫層析技術已經在臨床檢驗中得到了廣泛應用，其基本原理是通過膠體金標記物與分析物及包被抗體或抗原反應形成膠體金本身的顏色(紅色)，可通過肉眼觀察檢測結果。但是對于某些抗原或抗體含量極低的樣本，膠體金的顏色很淺且很難用肉眼來判斷結果，靈敏度低。

也有根據檢測帶結合的膠體金的數量不同，其所對應的吸光度不一致，而進行定量檢測，如中國專利201010132561.9，200910090040.9，200910090041.3等基于膠體金分別對HCG、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌腸毒素B等進行了定量檢測；中國專利03137101.9描述了膠體金免疫層析定量檢測裝置及定量方法。美國專利US60/576327和60/592202，及其在中國申請的專利200580025931.6都對免疫層析定量檢測進行了論述。但相比于熒光檢測，吸光度檢測具有靈敏度低、線性范圍窄等缺陷。

量子點(QDs)又叫半導體納米晶，通常是由II～VI族或III～V族元素組成的穩定的、尺寸介于1～20nm之間的納米微晶體，是20世紀90年代發展的一種具有優良光譜特性和光化學穩定性的生物熒光標記物。其具有許多優良的光學特性：(1)量子點的熒光發射光譜窄而對稱，熒光發射波長可調，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區。(2)量子點的吸收光譜寬且連續，可實現一元激發，多元發射，適合于多色標記。(3)量子點具有較強的光學穩定性。CdSe/ZnS量子點的光穩定性是羅丹明6G的100倍以上。(4)量子點摩爾吸光系數可以高達10⁶L/(mol·cm)，且熒光量子產率高(50～80％)，因而可產生較強熒光信號。(5)量子點斯托克斯位移較大，熒光壽命長(20～50ns)，使得信號可以顯著區分于背景和其它熒光基團。量子點是一種理想的應用于超靈敏和多組分生物化學分析的熒光探針，在熒光免疫分析和多組分檢測、免疫示蹤分子定位、納米生物傳感器、實時檢測、細胞成像、體內成像、疾病診斷等方面具有獨特的作用和廣泛應用前景。根據文獻報道，量子點作為新一代生物熒光標記物，具有取代傳統有機染料的潛力。

針對膠體金試紙條的不足和缺陷，量子點熒光定量檢測方法利用量子點多波長激發、高強度熒光強度、發射峰窄、峰形對稱、發光穩定性好的熒光特性，可提供一種量子點標記快速免疫層析試紙條的檢測方法，對分析物進行熒光定量檢測。本方法只需改變量子點的粒徑或種類，就可得到不同波長的熒光，用不同類型的量子點標記不同的抗體，可產生多色熒光，實現多組分的檢測，方法簡單快速，靈敏度高。

中國專利200810041133.8，200810186010.3，200810227473.X，200810204008.4，200810123521.0，201010234498.X，201010033615.6，201010206479.6等對量子點用于試紙條進行了描述，但出發點主要在利用基于量子點的基本熒光特性，利用特定抗原抗體對特定物質進行檢測，但均未考慮量子點及試紙條各組件對檢測的影響，且未闡述熒光定量檢測概念及具體方法。而現有定性及定量試紙條多對熒光檢測有較大的影響。

故現有定量試紙條主要存在如下缺點：

1)膠體金定量試紙條靈敏度低，線性范圍窄。

2)常用試紙條組件(如層析膜、底板、扣卡等)均有較強熒光背景，對量子點熒光信號的檢測有很大的干擾。

3)常用試紙條組件在550nm以下有較明顯的熒光噪聲，故處于此范圍的量子點較難與背景噪聲區分，很難達到很低的檢測下限。

4)量子點免疫層析檢測，大多依據檢測帶(T線)信號定性判定陰陽性，而未能準確定量分析物濃度，且沒有把質控帶當做內質控信號，對檢測帶進行校正。