[發明專利]一株益生屎腸球菌的篩選及應用

有效

• 申請號: 201110452087.2
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102747003A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 石德時;肖運才;畢丁仁;熊嬡嬡;王喜亮;高曉聰;許光勝;李自力;周祖濤;劉梅;許青榮;郝曉莉;肖宏德
• 申請（專利權）人: 武漢華大瑞爾科技有限公司;華中農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K1/16;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于獸用微生物添加劑技術領域，與抗生素添加劑領域有關，本發明涉及一種對常見腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌具有明顯的抑菌效果的屎腸球菌(Enterococcus?faecium)菌株的分離鑒定、安全性評價、抗逆性能及益生性能鑒定及作為飼料添加劑的用途。?

背景技術

自1946年Moore首次報道在飼料中添加抗生素能明顯提高肉雞的日增重以來，先后有60余種抗生素應用于畜牧業，在動物疾病防治、提高畜禽生產性能等方面發揮了重要作用。但隨著抗生素的大量使用，特別是不科學的濫用，導致耐藥菌株的大量產生、動物正常菌群失調、畜產品中藥物殘留等問題日益突顯，嚴重危害養殖業健康發展，影響人類食品安全，引起世界各國政府及業內人士的高度重視。在這種背景下，益生菌以其無毒、無殘留、無抗藥性的特點，被認為是規?；B殖中抗生素的最佳替代品(Shanahan?et?al，2000；Park?et?al.，2002)。2008年，中國農業部發布了1126號公告，《飼料添加劑品種目錄》明確規定飼用微生物添加劑的種類，屎腸球菌位列其中。?

盡管腸球菌被廣泛應用于食品、醫藥及飼料行業，但其作為益生菌的使用一直是備受爭議的話題，爭議的核心是：抗生素抗性基因或編碼毒力因子的基因可能轉移給胃腸道的其它微生物(Franz?et?al，2003)。因此，在篩選益生腸球菌時，除了要對其益生特性先行篩選外，還必須對菌株進行毒力因子和抗生素抗性進行檢測，以確保菌株的安全性。本發明在篩選菌株時，在國內首次對菌株益生特性、毒力因子和抗生素抗性同時進行考察檢測，另外還考慮菌株來源動物品種的抗逆性能。這樣的研究思路為最終得到優良菌株奠定了基礎。?

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的缺陷，分離篩選一株既安全又有明顯益生特性的益生菌，該菌株對常見腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌具有明顯的抑菌效果，經鑒定分離得到的該益生菌株為屎腸球菌(Enterococcus?faecium)，對其微生物菌學特征利用16SrDNA進行了鑒定，對其安全性、抗逆性及益生性及作為飼料添加劑的用途進行了相關試驗。?

本發明的技術方案如下：?

根據篩選目標和益生菌的生理生化特性及遺傳學特性，以經典的生理生化手段及現代分子生物學方法，從抗逆性強的地方優良品種“通城豬”的直腸內容物中，經過大量分選，分離篩選得到一株屎腸球菌菌株，申請人將其命名為屎腸球菌(Enterococcus?faecium)HDRsEf1，?已于2011年1月24日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC?NO：M2011031。?

屎腸球菌(Enterococcus?faecium)HDRsEf1的菌學特性如下所述：?

該菌株為革蘭氏陽性，呈單在、成雙或短鏈排列的卵圓形球菌。在KF鏈球菌瓊脂培養基上為紅色，光滑凸起，周邊整齊，1mm左右大小的菌落，菌落周圍培養基顏色由紫色變為黃色。過氧化酶陰性。菌株能耐受6.5％NaCl、pH9.6的生長環境；可在45℃生長、60℃耐受30min、膽汁-七葉苷水解試驗為陽性，能水解阿拉伯糖，說明該菌株屬于腸球菌屬屎腸球菌種；將其16S?rRNA基因進行克隆測序，結果在NCBI進行Blastn比較，發現其16S?rRNA與屎腸球菌(AB362603.1)的序列同源性最高，相似性為99％；另外，從該菌基因組中擴增出了屎腸球菌特異性片段ddl_E.faecium。?

該菌株在酸性和高膽鹽環境中的生存能力強，能耐受0.5％膽鹽，在pH2.5孵育2h后，其活菌數幾乎沒有下降；另外，該菌株對粘蛋白有明顯的粘附性(p＜0.05)。由此推測，該菌株能夠抵抗胃酸和小腸中高濃度膽鹽的不利影響，粘附于腸道存活下來發揮益生作用，這在動物試驗中也得到證實。?

該菌株繁殖能力很強，無遲緩期，很快進入對數增長期(0h～4h)，4h后進入穩定期，一直持續到18h，細菌數達到最大，為3.50×10⁹CFU/mL，18h后進入衰退期。?

該菌株雖然不產芽胞，但對高溫的耐受能力相對較強，可耐受60℃，30min；65℃，10min存活率大于97％；這為該菌株作飼料添加劑的應用于生產實際奠定了良好基礎。?