[發(fā)明專利]一種番茄抗病毒蛋白基因的克隆

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110451580.2
• 申請(qǐng)日: 2011-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN102796744A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜國勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 姜國勇
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/10;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/29;A01N47/44;A01P1/00;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 辛向東

技術(shù)領(lǐng)域

抗病毒蛋白是植物細(xì)胞中的一種重要的免疫組分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，從植物組織和細(xì)胞中分離的抗病毒蛋白對(duì)于研發(fā)生物農(nóng)藥具有重要意義。本發(fā)明通過改進(jìn)的DNA克隆技術(shù)和基因重組技術(shù)，將一種番茄抗病毒蛋白基因從野生秘魯番茄（L.peruvianum）葉片中分離出來，其技術(shù)發(fā)明屬于生物農(nóng)藥合成工程技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

抗病毒蛋白是植物細(xì)胞中的一種重要的免疫組分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，從植物組織和細(xì)胞中分離的抗病毒蛋白對(duì)于研發(fā)生物農(nóng)藥具有重要意義。?

利用植物組織中已經(jīng)合成的生物蛋白實(shí)現(xiàn)生物農(nóng)藥生產(chǎn)是現(xiàn)代農(nóng)藥應(yīng)用與生物防治研究的重要研究課題。栽培植物及其農(nóng)作物具有完備的防衛(wèi)系統(tǒng)，能夠抵御來自于微生物的侵染和危害。植物個(gè)體自身的生化反應(yīng)過程產(chǎn)生了許多拮抗病原菌的化合物――各種蛋白、多肽、酯類、酚類的生化小分子，這些生化物質(zhì)構(gòu)成了植物的防衛(wèi)反應(yīng)系統(tǒng)。來自于植物自身的合成產(chǎn)物通常對(duì)人類和植物本身是沒有危害的，也不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)面的影響，是環(huán)境友好型的環(huán)保產(chǎn)品。因此，植物化合物生產(chǎn)是生物防治和藥物生產(chǎn)的重要產(chǎn)業(yè)。?

自從1986年誕生第一株抗病毒工程植株以來，植物抗病毒基因工程研究不論在深度上還是廣度上都取得了很大的發(fā)展。來自于番茄的斑萎病毒抗性基因Sw-lp能夠在植物組織內(nèi)獲得植物免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)和抗性形狀的表達(dá)，有助于植物自身免疫系統(tǒng)的激發(fā)和對(duì)斑萎病毒的抗病性。番茄的Sw-lp基因位于第9號(hào)染色體上，與分子標(biāo)記CT?220有2.0cM，西班牙的科學(xué)家已經(jīng)將番茄的兩個(gè)BAC（?C09HBa0226D21?和C09HBa0109D11?）測序，比對(duì)已經(jīng)發(fā)表的Sw-5a和Sw-5b基因序列，我們利用野生的秘魯番茄克隆了Sw-lp基因，該基因能夠拮抗番茄斑萎病毒兩個(gè)毒株（TSWV-A和TSWV-D）的侵染。Sw-lp基因全長為3738p，編碼有1245氨基酸，是一個(gè)屬于CC-NBS-LRR類型的抗病毒蛋白。?

發(fā)明內(nèi)容

本研究采用植物中存在的抗病毒蛋白基因進(jìn)行重組抗病毒基因的克隆技術(shù)方法。這種抗病毒蛋白對(duì)自身基因轉(zhuǎn)錄與蛋白的合成不起破壞作用，但能特異失活與其基因互作的病毒蛋白，抑制病毒蛋白質(zhì)的合成，使得浸染的病毒不能完成正常的侵染過程。大量的研究結(jié)果表明，植物體中的抗病毒蛋白具有專化型的病毒蛋白抑制作用。Sw-lp抗斑萎病毒蛋白基因是一種從中野生的秘魯番茄（L.peruvianum）葉片中分離提取的基因，其編碼蛋白是一種具有抗斑萎病毒侵染特性的抗病毒蛋白。本發(fā)明的目的是通過基因克隆技術(shù)和基因重組技術(shù)，從植物葉片中分離和克隆抗病毒蛋白，并且在原核中生物體中表達(dá)具有抗病毒特性的蛋白，實(shí)現(xiàn)有利于環(huán)境和人類健康的生物制劑和生物農(nóng)藥的應(yīng)用。?

本發(fā)明應(yīng)用DNA重組技術(shù)和分子生物學(xué)方法，從野生番茄葉片中分離了一個(gè)長度為3738bp的抗斑萎病毒蛋白的基因Sw-lp，并在大腸桿菌中表達(dá)了這段目的基因。?

本發(fā)明的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，1）從植物DNA中分離了一種抗斑萎病毒蛋白基因；2）在大腸桿菌中重組和表達(dá)了該基因。該基因片斷的核苷酸序列為SEQ?N0.1所示的長度從ATG到TGA為3738bp。該抗斑萎病毒蛋白的氨基酸序列為SEQ?N0.2所示的長度1245個(gè)氨基酸。?

所述的長度為3738bp的抗病毒蛋白基因Sw-lp，其插入到克隆載體pMD-18中時(shí)，獲得了含有Sw-lp基因擴(kuò)增片斷的重組DNA質(zhì)粒pMD-18?(lp）。質(zhì)粒pMD-18?(lp）包含有長度為3738bp的抗病毒蛋白基因Sw-lp。該質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E.coli）BL21獲得大腸桿菌（E?.?coli）pBL21（Sw-1）克隆菌株，經(jīng)過培養(yǎng)能夠表達(dá)1245個(gè)氨基酸的抗斑萎病毒的蛋白；該菌株已送中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏時(shí)間為2011?年12月29?日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。?

本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)：一是從野生秘魯番茄葉片的DNA中分離出了抗病毒基因；二是所分離的抗病毒蛋白基因能夠通過大腸桿菌表達(dá)；三是該基因克隆的方法是與基因重組技術(shù)相結(jié)合；四是該基因經(jīng)過重組可以獲得生物農(nóng)藥。?