[發明專利]二硫鍵穩定的抗bFGF人源雙鏈抗體及其制備方法與應用

無效

• 申請號: 201110450855.0
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102532319A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 鄧寧;江浩武;亢中奎;王宏;宋其芳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22;C12N15/13;C12N15/10;C12N15/79;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種二硫鍵穩定的抗bFGF人源雙鏈抗體，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述二硫鍵穩定的抗bFGF人源雙鏈抗體，其特征在于：編碼所述的二硫鍵穩定的抗bFGF人源雙鏈抗體的基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO.2所示。

3.權利要求1所述的二硫鍵穩定的抗bFGF人源性雙鏈抗體的制備方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)以編碼抗bFGF單鏈抗體的V_L基因和V_H基因片段為模板，通過重疊PCR和PCR，將抗體VL第100位氨基酸Gly和VH第44氨基酸Gly定點突變為Cys，輕重鏈可變區基因之間通過一個連接肽的基因片段相連，構建成編碼V_L-GGGGS-V_H的基因片段；V_H基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；V_L基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

(2)將步驟(1)得到的V_L-GGGGS-V_H的基因片段克隆到真核表達載體中表達，純化，得到二硫鍵穩定的抗bFGF人源性雙鏈抗體。

4.根據權利要求3所述的二硫鍵穩定的抗bFGF人源性雙鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟(1)具體包含以下步驟：

①設計引物：

引物1：5′-GCGGCCGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCC-3′；

引物2：5′-TAGGACGGTCAGCTTGGTCCCACAGCCGAATACCACAGTGCTGCT-3′；

引物3：5′-CGAGCCACCGCCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC-3′；

引物4：5′-GGTGGCGGTGGCTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT-3′；

引物5：5′-CCCACTCCAGACACTTCCCTGGAGCCTGGCGGA-3′；

引物6：5′-TCCAGGGAAGTGTCTGGAGTGGGTTTCATACAT-3′；

引物7：5′-GGATCCTCAATGATGATGATGATGGTGTGAGGAGACAGTGACCAT-3′；

②PCR定點突變V_L第100位氨基酸Gly為Cys，擴增得到基因片段V_L-GGGGS：

A、以編碼抗bFGF單鏈抗體的V_L基因和V_H基因片段為模板，以引物1和引物2PCR擴增得到第100位氨基酸由Gly突變為Cys的V_L；

B、以步驟A得到的產物為模板，接著以引物1和引物3PCR擴增得到基因片段V_L-GGGGS；

③PCR定點突變V_H第44位氨基酸Gly為Cys，擴增得到基因片段V_H-GGGGS：

C、以編碼抗bFGF單鏈抗體的V_L基因和V_H基因片段為模板，以引物4和引物5PCR擴增得到第44位氨基酸Gly突變為Cys的V_H-GGGGS；

D、以編碼抗bFGF單鏈抗體的V_L基因和V_H基因片段為模板，接著以引物6和引物7PCR擴增得到帶有BamHI位點的部分的V_H-GGGGS；

E、將步驟C和步驟D得到產物進行拼接，得到拼接產物；接著以該拼接產物為模板，以引物4和引物7為模板，PCR擴增得到完整的V_H-GGGGS；

④PCR拼接、擴增基因片段V_L-GGGGS-V_H：將步驟②和步驟③最終得到產物進行拼接，得到拼接產物；接著以該拼接產物為模板，以引物1和引物7PCR擴增得到完整的V_L-GGGGS-V_H。