[發明專利]木聚糖酶AnxB及其編碼基因

無效

• 申請號: 201110450061.4
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN103184203A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 張山;董志揚
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N5/10;C12N7/01;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及木聚糖酶AnxB及其編碼基因。

背景技術

木聚糖(xylan)是一類分子結構變化范圍很大的多糖，從僅由β-1，4糖苷鍵連接的多聚木糖線性分子到高度分支的異聚多糖。木聚糖是植物半纖維素的重要組分，約占植物總糖的三分之一，是自然界中除纖維素以外含量最豐富的再生生物資源。木聚糖酶(E.C?3.2.1.8)是一類以內切方式降解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵的酶系。近年來，木聚糖酶在食品、紡織、飼料、能源工業中都顯示了廣闊的應用前景。特別是在制漿造紙工業中該酶用于紙漿漂白，能夠增加紙張白度，改善紙張性能，降低漂白用化學物質的用量，從而有效減輕造紙業對環境的污染。根據木聚糖酶催化區域的氨基酸組成和疏水簇序列分析，可將其歸為F/10和G/11兩大家族。相比于F/10家族木聚糖酶，G/11家族木聚糖酶具有分子量較小，易于穿透纖維素網狀結構以及不含纖維素酶活性的特點，從而更適合應用于紙漿漂白工藝中。

熱穩定性是木聚糖酶工業生產、儲藏、運輸以及應用過程中追求的又一重要特性。因此，獲得熱穩定性的木聚糖酶對于木聚糖酶的應用具有重要的實踐價值。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種熱穩定性高的木聚糖酶(蛋白質)及其編碼基因與應用。

本發明所提供的蛋白質，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

本發明所提供的蛋白質的編碼基因，為任何編碼上述蛋白的DNA，具體為核苷酸序列如序列表中序列3所示的DNA。

含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬于本發明的保護范圍。

上述任一所述蛋白質在作為木聚糖酶中的應用也屬于本發明的保護范圍。

實驗證明，本發明的木聚糖酶，在保持原有木聚糖酶特性的基礎上，其半衰期顯著延長，Tm值顯著增高，最適溫度也顯著提高。因此，本發明的木聚糖酶在木聚糖應用領域將有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為AnxB與其突變體AnxB-M2熱穩定性比較。(A)AnxB與AnxB-M2在65℃熱穩定性比較；(B)AnxB與AnxB-M2Tm值比較。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

黑曲霉Aspergillus?niger?UV-11?CGMCC?No.4.4309購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

pET-28a(+)購自Novagen，產品目錄號為69865-3；

實施例1、木聚糖酶AnxB及其熱穩定性的提高

將黑曲霉Aspergillus?niger?UV-11?CGMCC?No.4.4309產生的木聚糖酶AnxB中五個氨基酸相應地突變為Y11，H12，D13，Y15和F16，產生突變體AnxB-M2，并將其熱穩定性與其相應的野生型木聚糖酶進行比較。

一、木聚糖酶AnxB的制備及穩定性檢測

實驗組：

1、PCR擴增木聚糖酶SlxB的編碼基因

以黑曲霉Aspergillus?niger?UV-11?CGMCC?No.4.4309的基因組DNA為模板，用引物AnxB-P1、AnxB-P2(表1)進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。

2、酶切、連接

用NdeI和EcoRI雙酶切PCR擴增產物，與預先使用NdeI和EcoRI雙酶切的pET-28a(+)進行連接，得到重組載體；

3、轉化、篩選以及測序驗證

用氯化鈣化學轉化法將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，用含有卡拉霉素(50μg/ml)的LB培養基進行篩選培養，挑取單菌落，并進行擴大培養和提取質粒，進行測序驗證.結果獲得的序列(即AnxB編碼基因)如序列表中序列1所示；該序列編碼序列2所示蛋白(即AnxB蛋白)。證明構建的質粒及重組菌正確。將陽性克隆記作BL21-pET-AnxB，陽性質粒記作pET-AnxB。

4、酶的表達：