[發明專利]攜帶牛病毒性腹瀉病毒非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白及其重組表達方法與應用

無效

• 申請號: 201110449924.6
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102517260A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 章金剛;王麗;尹惠瓊;楊姝;張啟模
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;G01N33/569
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白，是在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的氨基(N)端連接有折疊酶DsbA的融合蛋白。

2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述DsbA自氨基端與氧化還原功能相關的兩個半胱氨酸(Cys)突變成絲氨酸(Ser)。

3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白，是下述氨基酸殘基序列之一：

1)序列表中的SEQ?ID?No：1；

2)將序列表中SEQ?ID?No：1的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有絲氨酸蛋白酶活性和RNA解旋酶活性的蛋白質。

4.編碼權利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白的基因。

5.根據權利要求4所述的基因，其特征在于，編碼權利要求3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ?ID?No：2的DNA序列；

2)編碼序列表中SEQ?ID?No：1的DNA序列；

3)與序列表中SEQ?ID?No：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的核苷酸序列；

4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ?ID?No：2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。

6.含有權利要求4或5所述基因的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。

7.一種重組表達權利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白的方法，是將含有權利要求4或5或6所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因的重組表達載體導入宿主中，經表達、純化得到攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白；

所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因采用轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增得到，用于擴增該基因的上、下游引物的核苷酸序列分別如序列表中SEQ?ID?No：3和SEQ?ID?No：4所示。

8.根據權利要求7所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白的重組表達方法，其特征在于，用于構建含有上述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因的重組表達載體的出發載體為任意一種攜帶折疊酶DsbA基因的原核表達載體pET-DsbA；以pET-DsbA為出發載體構建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因的重組表達載體為pET-DsbA-NS3；所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因位于原核表達載體pET-DsbA多克隆位點處的BagII和Nhe?I限制性酶切位點之間。

9.根據權利要求7或8所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白的重組表達方法，其特征在于，所述宿主為大腸桿菌；所述大腸桿菌具體為BL21(Rosetta)、BL21(DE3)、BL21(DE3，plysS)、E.coli?JM109、E.coli?HB101或E.coli?Topl0，優選為BL21(Rosetta)；以大腸桿菌BL21(Rosetta)為出發菌株構建的含有攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白編碼基因的重組表達載體pET-DsbA-NS3的工程菌為BL21(Rosetta)/DsbA-NS3。

10.權利要求1或2或3所述攜帶牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)非結構蛋白NS3優勢區的融合蛋白在牛病毒性腹瀉病毒的ELISA檢測中的應用。