[發明專利]兔抗豬TPO多克隆抗體的制備與應用

無效

• 申請號: 201110449773.4
• 申請日: 2011-12-29
• 公開（公告）號: CN102532322A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 王穎;彭靜;李艷玲;徐寧迎
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;C07K1/22;G01N33/53
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術領域

本發明屬于生命科學技術領域，具體涉及一種兔抗豬TPO（甲狀腺過氧化物酶，thyroid?peroxidase）多克隆抗體的制備及應用。

背景技術

TPO是一種糖基化血紅素蛋白，是催化甲狀腺激素合成的關鍵酶。它參與了兩個重要的反應：甲狀腺球蛋白酪氨酸殘基的碘化和碘化酪氨酸的偶聯作用，從而產生T3和T4。TPO是甲狀腺微粒體抗原的重要組成部分之一，與自身免疫性甲狀腺疾病的發生、發展密切相關。TPO不僅在甲狀腺細胞表面表達，還在胞漿中表達，是參與補體介導的細胞毒性的細胞表面抗原，具有特殊的免疫學特性。正常時，TPO不會溢出甲狀腺入血，但當甲狀腺發生病變時，濾泡細胞結構會受到破壞，TPO就會由被隔絕于甲狀腺濾泡細胞腔邊緣向外周血溢漏，并作為AITD一種重要自身抗原刺激機體免疫系統產生甲狀腺組織成分抗體即TPO-Ab，通過激活補體和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用對甲狀腺造成免疫性損傷。目前關于豬TPO蛋白的抗體尚無商業化產品，限制了對豬TPO蛋白生物學功能的深入分析。

發明內容

本發明的目的在于提供一種特異性好、純度高、可與甲狀腺細胞的TPO蛋白發生特異性結合反應的兔抗豬TPO多克隆抗體的制備及應用。

本發明的具體實施步驟如下：

步驟(1).經DNAStar軟件分析后，將豬的TPO蛋白N端第95????????????????????????????????????????????????113位20個氨基酸作為兔抗豬TPO多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下：

GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeu。

步驟(2).用多肽自動合成儀化學合成豬的TPO多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯，形成豬的TPO多肽-KLH復合蛋白；

步驟(3).將豬的TPO多肽-KLH復合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點注射，先后注射三次，每次間隔710天；

步驟(4).第三次注射1012天后，收集、分離得到含有兔抗豬TPO多克隆抗體的血清；ELISA檢測血清中兔抗豬TPO多克隆抗體的效價；

所述的兔抗豬TPO多克隆抗體，其效價在1:50000以上；

步驟(5).將步驟(2)合成并純化的豬的TPO多肽與溴化氰活化的Sepharose?4B偶聯，制備多肽親和層析柱；

步驟(6).將含有兔抗豬TPO多肽抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4℃孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗豬TPO多克隆抗體；

所述的步驟(2)豬的TPO多肽的純化，采用HPLC對其進行純化，使豬的TPO多肽的純度達到95%以上；

所述的步驟(6)兔抗豬TPO多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。

兔抗豬TPO多克隆抗體應用廣泛，可與豬甲狀腺細胞TPO蛋白發生特異性結合反應，可用于免疫組化等實驗的要求。

本發明有益效果如下：

本發明制備的抗TPO多克隆抗體具有特異性好、純度高的特點。本發明兔抗豬TPO多克隆抗體的制備，為深入研究豬TPO蛋白的生物學功能和在甲狀腺細胞水平調控豬的生長發育提供了一個重要工具，具有重要的理論意義和生產價值。

附圖說明

????圖1?為本發明在豬甲狀腺細胞中的免疫組化染色。

具體實施方式

????下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

實施例1：?

兔抗豬TPO多克隆抗體的制備步驟如下：

步驟(1).經DNAStar軟件分析后，將豬的TPO蛋白N端第95113位20個氨基酸作為兔抗豬TPO多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下：

GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeu。

步驟(2).用多肽自動合成儀化學合成豬的TPO多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯，形成豬的TPO多肽-KLH復合蛋白；

步驟(3).將豬的TPO多肽-KLH復合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點注射，先后注射三次，每次間隔710天；

步驟(4).第三次注射1012天后，收集、分離得到含有兔抗豬TPO多克隆抗體的血清；ELISA檢測血清中兔抗豬TPO多克隆抗體的效價；

所述的兔抗豬TPO多克隆抗體，其效價在1:50000以上；