[發(fā)明專利]培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110448806.3
• 申請(qǐng)日: 2011-05-17
• 公開（公告）號(hào): CN102787094A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李暉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李暉
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 封新琴

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01110127667.4，發(fā)明名稱為培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法的中國發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)日為2011年5月17日)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細(xì)胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細(xì)胞與不同器官的特異性功能直接相關(guān)，如肺的氣體交換功能、腎的過濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、皮膚具有保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境的傷害。而這些重要器官一旦發(fā)生病變或退化就會(huì)威脅人類的健康，因?yàn)檫@些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細(xì)胞也不能相互取代其它器官的細(xì)胞。

特異性分化的細(xì)胞，如腎上皮細(xì)胞、胰腺的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、真皮的毛囊和腺體細(xì)胞都是很難再生的，更不要說在體外進(jìn)行培養(yǎng)增殖了。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括各種轉(zhuǎn)基因和克隆動(dòng)物)是用于疾病發(fā)病機(jī)理研究和新藥研發(fā)的必要工具。但是，對(duì)于分離自人和哺乳動(dòng)物的原代上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍然是很困難的。應(yīng)用目前的無血清培養(yǎng)基，有的只能進(jìn)行短期的原代培養(yǎng)(存活數(shù)天，如肺和胰腺等上皮細(xì)胞)，有的只能進(jìn)行有限的傳代培養(yǎng)(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細(xì)胞)，有的甚至根本不能體外培養(yǎng)(如肝和結(jié)腸等上皮細(xì)胞)，只有來自于人體皮膚的角化上皮細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)10代左右。而且從每個(gè)動(dòng)物或活體組織樣品中獲得的上皮細(xì)胞產(chǎn)量仍然很低，包括細(xì)胞的數(shù)量、直接分離或短期培養(yǎng)的細(xì)胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細(xì)胞的增殖速度也極為有限。

為了在體外進(jìn)行上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，目前國外嘗試通過遺傳操作，如轉(zhuǎn)入病毒(SV40T或HPV16E6E7)或細(xì)胞癌基因，可以延長體外細(xì)胞存活的代數(shù)。然而遺傳操作的最大缺點(diǎn)是會(huì)改變這些細(xì)胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細(xì)胞丟失其正常生理功能，如p53和pRB信號(hào)通路常常被抑制。而且，這些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞是不可能重新再移植進(jìn)機(jī)體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞的技術(shù)，上述這些細(xì)胞在當(dāng)今世界的醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領(lǐng)域，它們就代表著最初來源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領(lǐng)域，它們還常常被用來作為“正常細(xì)胞”對(duì)照。而且它們的市場價(jià)格還非常昂貴。

抗腫瘤藥物研究的第一步就是藥物對(duì)癌細(xì)胞的特異性毒性實(shí)驗(yàn)，目前所用的癌細(xì)胞株(如HeLa和A539等)多在體外傳代數(shù)年甚至數(shù)十年，它們?cè)诤艽蟪潭壬弦巡荒芊磻?yīng)同類型人體惡性腫瘤的特性，一些實(shí)驗(yàn)室還存在大量癌細(xì)胞株的交叉污染。而且對(duì)于不同的個(gè)體，即使同一類型的腫瘤也可能由不同的原因或機(jī)制所導(dǎo)致，因此對(duì)于每一種腫瘤，都需要有能代表其特定發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞株來進(jìn)行新藥研發(fā)。更為突出的例子，如前列腺癌的研究領(lǐng)域根本沒有人類原發(fā)前列腺癌的細(xì)胞系，僅有的細(xì)胞系(LnCAP，PC-3，DU-145)都是來自轉(zhuǎn)移后的腫瘤組織。盡管如此，全世界90％以上的腫瘤研究和幾乎所有抗癌新藥的研究還在繼續(xù)使用著可能根本沒有代表性的癌細(xì)胞株。因此，目前癌癥研究和新藥研發(fā)要解決的關(guān)鍵問題是，如何能獲得反應(yīng)各種類型人體腫瘤特性、同種腫瘤代表不同個(gè)體特性或不同發(fā)病機(jī)制的癌細(xì)胞。當(dāng)然，歸根結(jié)底的真正難題是缺乏有效的上皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)。另外，抗腫瘤藥物存在的很多毒副作用，很大程度上是因?yàn)樾滤幯芯咳狈φ５募?xì)胞對(duì)照。若能得到來自于同一個(gè)體同一組織的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞(美國Asterand公司用上述HPVE6E7轉(zhuǎn)化得到的所謂的“正常”和癌的前列腺細(xì)胞，價(jià)格雖然高達(dá)1,2000美金/對(duì)，但還是十分搶手)，新藥研發(fā)的第一步將會(huì)回歸科學(xué)，抗癌新藥研究的歷史必將重寫。

再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的一種嶄新的治療模式，即以再生、再造、代替和新生為基本治療原理的現(xiàn)代干細(xì)胞移植治療術(shù)，利用干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞)具有向各種細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變能力，治療臨床上眾多的、目前尚無治療辦法的變性、壞死性和損傷性疾病，具有顯著和獨(dú)特的醫(yī)療效果。然而目前面臨的困境是，雖然胚胎干細(xì)胞具有分化能力，再生性和可塑性強(qiáng)，但可能致瘤和面臨倫理爭議，如何誘導(dǎo)其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的難題；而成體干細(xì)胞來源稀少，難以識(shí)別、分離及純化，因此阻礙了其臨床應(yīng)用；目前新興的研究熱點(diǎn)——誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，由于其涉及遺傳操作導(dǎo)致細(xì)胞遺傳背景的改變，且導(dǎo)入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潛能而不能用于臨床治療。