[發(fā)明專利]一種柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110448677.8
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102559606A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高強;李雅靜;王巍巍;尹衛(wèi)東
• 申請（專利權(quán)）人: 北京科興生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/125;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/06;C12N5/16;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒學(xué)、分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

手足口病是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報導(dǎo)。1957年新西蘭首次報導(dǎo)，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名。早期發(fā)現(xiàn)的手足口病的病原體主要為Cox?A16型，手足口病與EV?71感染有關(guān)的報導(dǎo)則始自20世紀70年代初，1972年EV?71在美國被首次確認。此后EV?71感染與Cox?A16感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。其多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。個別重癥患兒如果病情發(fā)展快，導(dǎo)致死亡。其中柯薩奇病毒(Coxasckievirus)A16型(Cox?A16，CA16)是手足口病主要病原體之一，它是小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，呈20面立體對稱球形。雖然重癥和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但特別值得關(guān)注的是Cox?A16與心肌炎、心包炎、難治性休克等綜合性疾病相關(guān)。

我國自1981年在上海始見本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西寧、廣東等十幾個省市均有報道。手足口病的爆發(fā)和流行嚴重影響了人們的日常生活，造成巨大的經(jīng)濟損失和社會負擔(dān)，利用病毒疫苗從根本上切斷病毒的傳播是目前較為有效的預(yù)防途徑之一，目前尚無CA16病毒疫苗的報道，因此分離出適于疫苗生產(chǎn)的CA16病毒株具有巨大的經(jīng)濟和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC?No.5373，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期2011年10月18日。在電鏡下觀察該毒株，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約23-30nm。

前述的應(yīng)用，是將所述柯薩奇病毒A16型病毒株經(jīng)過感染細胞(如Vero細胞、人二倍體細胞或其它敏感細胞)、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，加入免疫佐劑(如氫氧化鋁等)后即得柯薩奇病毒A16型疫苗。

前述的應(yīng)用，病毒株感染細胞后，于37℃培養(yǎng)，待細胞病變達75％以上時，收獲病毒液。

前述的應(yīng)用，滅活使用β-丙內(nèi)酯或甲醛溶液。優(yōu)選用1∶100-1∶10000(v/v)的β-丙內(nèi)酯或1∶1000-1∶10000(v/v)的甲醛溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以后進行。

本發(fā)明還提供，以本發(fā)明的柯薩奇病毒A16型病毒株(CGMCC?No.5373)為免疫原制備抗體或雜交瘤細胞或抗血清。其中，抗血清的制備方法為：病毒株經(jīng)過感染細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用疫苗原液免疫動物，獲得抗血清。所述動物優(yōu)選為猴、羊、兔等。

通過進一步研究本發(fā)明病毒株產(chǎn)生的VP1蛋白，VP1保守區(qū)序列分析和質(zhì)譜分析結(jié)果表明該毒株為CA16病毒，且無外源物污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。

借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果：

(一)通過蝕斑法分離得到的本發(fā)明的單克隆CA16病毒株，其子代病毒表現(xiàn)為遺傳穩(wěn)定，可用于人用CA16疫苗生產(chǎn)。

(二)利用本發(fā)明的CA16病毒株或由其生產(chǎn)的疫苗可用于預(yù)防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。

(三)本發(fā)明的CA16病毒株可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.0lg?CCID₅₀/ml。

附圖說明

圖1為本發(fā)明CA16病毒株電鏡觀察結(jié)果(放大比例：100,000倍)。

圖2為本發(fā)明CA16病毒株蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實施例1?CA16病毒株的分離、培養(yǎng)和鑒定

(一)病毒分離、培養(yǎng)

自2010年浙江省手足口疫區(qū)(手足口累計發(fā)病人數(shù)達111783)收集CA16病毒PCR結(jié)果陽性的病人糞便標本，經(jīng)處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養(yǎng)三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。