[發明專利]一種柯薩奇病毒A16型病毒株及其應用

有效

• 申請號: 201110447936.5
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102533671A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 高強;李雅靜;王巍巍;尹衛東
• 申請（專利權）人: 北京科興生物制品有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/125;A61P31/14;C07K16/10;C07K16/06;C12N5/16;G01N33/569;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王加嶺;張慶敏

技術領域

本發明涉及病毒學、分子生物技術領域，具體地說，涉及一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應用。

背景技術

手足口病(Hand?foot?mouth?disease，HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔等部位的皰疹，少數患兒可引起肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥。個別重癥患兒如果病情發展快，導致死亡。引發手足口病的腸道病毒有20多種(型)，柯薩奇病毒A組的16、4、5、9、10型，B組的2、5型，以及腸道病毒71型，均為手足口病較常見的病原體。主要經糞-口、呼吸道和密切接觸傳播，可通過胎盤傳給胎兒引起官內感染。其中柯薩奇病毒(Coxasckievirus)A16型(Cox?A16，CA16)是手足口病主要病原體之一，它是小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，呈20面立體對稱球形。雖然重癥和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但特別值得關注的是Cox?A16與心肌炎、心包炎、難治性休克等綜合性疾病相關。

世界大部分地區均有此病流行的報道，我國自1981年在上海始見本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、西寧、廣東等十幾個省市均有報道。手足口病的爆發和流行嚴重影響了人們的日常生活，造成巨大的經濟損失和社會負擔，利用病毒疫苗從根本上切斷病毒的傳播是目前較為有效的預防途徑之一，目前尚無CA16病毒疫苗的報道，因此分離出適于疫苗生產的CA16病毒株具有巨大的經濟和社會效益。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應用。

為了實現本發明目的，本發明的一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC?No.5372，現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期2011年10月18日。在電鏡下觀察該毒株，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約23-30nm。

前述的應用，是將所述柯薩奇病毒A16型病毒株經過感染細胞(如Vero細胞、人二倍體細胞或其它敏感細胞)、培養、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，加入免疫佐劑(如氫氧化鋁等)后即得柯薩奇病毒A16型疫苗。

前述的應用，病毒株感染細胞后，于37℃培養，待細胞病變達75％以上時，收獲病毒液。

前述的應用，滅活使用β-丙內酯或甲醛溶液。優選用1∶100-1∶10000(v/v)的β-丙內酯或1∶1000-1∶10000(v/v)的甲醛溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以后進行。

本發明還提供，以本發明的柯薩奇病毒A16型病毒株(CGMCC?No.5372)為免疫原制備抗體或雜交瘤細胞或抗血清。其中，抗血清的制備方法為：病毒株經過感染細胞、培養、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用疫苗原液免疫動物，獲得抗血清。所述動物優選為猴、羊、兔等。

通過進一步研究本發明病毒株產生的VP1蛋白，VP1保守區序列分析和質譜分析結果表明該毒株為CA16病毒，且無外源物污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。

借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：

(一)通過蝕斑法分離得到的本發明的單克隆CA16病毒株，其子代病毒表現為遺傳穩定，可用于人用CA16疫苗生產。

(二)利用本發明的CA16病毒株或由其生產的疫苗可用于預防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。

(三)本發明的CA16病毒株可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達6.61g?CCID50/ml。

附圖說明

圖1為本發明CA16病毒株電鏡觀察結果(放大比例：100,000倍)。

圖2為本發明CA16病毒株蛋白質譜分析結果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

實施例1?CA16病毒株的分離、培養和鑒定

(一)病毒分離、培養

自2010年浙江省手足口疫區(手足口累計發病人數達111783)收集CA16病毒PCR結果陽性的病人糞便標本，經處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。

(二)病毒鑒定