[發明專利]一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法及其制品

有效

• 申請號: 201110447363.6
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102488893A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 楊保收;劉月煥;何平有;徐倩倩;毛雅元;韓春華;林健;劉濤
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N7/08;A61P31/14
• 代理公司: 石家莊冀科專利商標事務所有限公司 13108
• 代理人: 李羨民;郭紹華

技術領域

本發明涉及一種疫苗的制備方法及其制品，更具體地說涉及一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活苗的方法及其制品，屬于生物技術領域。

背景技術

鴨出血性卵巢炎（Duck?Hemorrhagic?Ovaritis，DHO）是一種新近流行的、急性、高度接觸性鴨傳染病，其病原為鴨出血性卵巢炎病毒（Duck?Hemorrhagic?Ovaritis?Virus，DHOV），在病毒分類上屬于黃病毒科的成員。該病毒感染不同日齡鴨，產蛋鴨主要表現采食量急劇下降，產蛋率急劇下降，部分鴨出現癱瘓現象。剖解病變主要表現為卵巢出血，卵泡變形、變性，卵巢、卵黃、睪丸、輸卵管和輸精管萎縮，肝臟表面有粟粒狀結節。商品肉鴨表現為死淘率增加。

新近科學研究情況：在病毒分類地位的研究中，曹貞貞、張存等人通過對鴨出血性卵巢炎病毒與黃病毒屬恩塔亞病毒群（Ntay?a?virus?group，NTAV群）和乙型腦炎病毒群（Japanese?encepHalitis?virus?group，JEV群）中選NS1序列已知的病毒進行序列同源性分析和進化分析，發現該病毒與黃病毒科黃病毒屬的巴格扎病毒的遺傳距離位于病毒分類學種的水平。蘇敬良、萬春和、施少華等人的研究也表明分離獲得的引起種（蛋）鴨產蛋驟降新病毒的核苷酸序列第9～777位與坦布蘇病毒（TMUV）的同源性最高，為88.7％；遺傳進化分析表明WR株病毒與坦布蘇病毒、圣路易斯腦炎病毒（SLEV）、以色列火雞腦膜炎病毒（ITV）、恩塔亞病毒（NTAV）具有相似的祖先。在診斷方面，曹貞貞、萬春和、蘇敬良、滕巧泱等人報道可以采用臨床癥狀、大體及組織病理變化、PCR擴增和病毒分離等方法確診該病。

該病的流行情況：2010年4月，自中國浙江首先發現以產蛋鴨產蛋量急劇下降為主要特征的疾病以來，先后在江蘇、山東、河北、北京等省市發生類似的疾病。鴨出血性卵巢炎已經成為近期危害中國養鴨業的主要疫病之一。各種蛋鴨、櫻桃谷種鴨和臺灣白改種鴨均有發生，但主要見于開產蛋鴨。受染鴨群幾乎100%發病，死亡率為5%～30%不等，蛋鴨產蛋率由80%以上下降至10%~30%甚至10%以下，嚴重者停產，雖然產蛋率可逐漸恢復，但從發病至恢復正常，約需1~2月；種鴨發病后種蛋的受精率和孵化率降低；商品肉鴨感染后死淘率明顯增加。因此，該病給養鴨業帶來巨大的經濟損失，這使得養鴨業一度陷入絕境。

疾病的防控：目前，鴨出血性卵巢炎發生后，養殖戶通常采用的控制措施是藥物防治，大劑量使用各種抗菌素和抗病毒藥，但往往無濟于事，在部分鴨場甚至出現藥物中毒的現象進一步增加了疫病的嚴重性。專家推薦的防治該病有效措施是注射疫苗，但目前尚未找到較好的疫苗株、大規模和高效價培養病毒的細胞系，疫苗評價模型尚未建立，制約著目前疫苗的開發。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術之缺陷提供一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法及其產品。

本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。

一種用細胞系生產鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，所述細胞系選自倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系。

上述方法，它包括如下步驟：

（1）選育毒株：將鴨出血性卵巢炎病毒鴨胚適應株在細胞系中連續傳代培養3次，取傳代適應毒株利用蝕斑純化技術對其連續純化培養三次，選取在倉鼠腎細胞系或非洲綠猴腎細胞系中培養效價高、免疫原性好的毒株作為候選病毒株；

（2）建立毒種種子批：將步驟（1）所得候選株病毒接種至細胞系中，傳代培養至第15代，取第5～15代作為毒種種子批；

（3）制備細胞毒液：棄去形成良好單層細胞的細胞生長液，接種步驟（2）所得毒種種子批，吸附0.5～1h后，加入細胞維持液，繼續培養，48～120h后細胞病變（CPE）達到80%以上時收獲細胞毒液，該細胞毒液病毒含量≥10^6.5?TCID₅₀/1ml；

（4）滅活病毒：取步驟（3）所得細胞毒液凍融兩次后，加入細胞毒液總量（V/V）0.1～0.2%的滅活劑，在37℃下振蕩滅活16～24h；

（5）洗滌與濃縮細胞毒液：將步驟（4）所得滅活好的細胞毒液濃縮至原來體積的1/2，然后用等量pH值為7.0～7.2的PBS溶液洗滌，再進行濃縮，如此反復2～3遍，隨后進行最后一次濃縮，將細胞毒液濃縮為原來體積的1/5～1/10，細胞毒液蛋白含量應不大于400ug/ml；