[發明專利]L-半胱氨酸酶法轉化制備方法

有效

• 申請號: 201110446250.4
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102517352A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 焦慶才;劉均忠;劉茜;肖國安;王先兵;曾慶群
• 申請（專利權）人: 南京大學;湖北新生源生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12P13/12
• 分類號: C12P13/12
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及L-半胱氨酸的酶法轉化制備方法。

二、背景技術

L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人體的非必需氨基酸之一，其所帶的巰基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于醫藥領域、化妝品工業、食品領域和飼料添加劑領域等，具有非常廣泛的應用。

根據目前文獻報導L-半胱氨酸的制備方法主要有提取法、化學合成法、發酵法和酶轉化法。

1、提取法

目前國內生產L-半胱氨酸主要以人或動物毛發為原料，先經酸水解提取L-胱氨酸，再經過電解還原制得L-半胱氨酸。該方法大規模工業化生產受到原料來源的限制，產物中易混入其它氨基酸，分離難度大，環保成本高。也有廠家在生產L-半胱氨酸的相關產品中回收L-胱氨酸，曾慶群等(CN?101104599A，2008)對N-乙酰-L-半胱氨酸生產過程中排放的廢液進行氧化處理，分離回收了L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生產成本。

但是，近年來隨著人們環保意識的增強或宗教信仰等原因，一些西方國家禁用由動物毛發為原料制得的L-半胱氨酸，因此尋求新的制備L-半胱氨酸的方法勢在必行。

2、化學合成法

化學合成法是利用氯代烷類化合物經過氧化反應、加成反應、還原反應、取代反應，最后得到DL-半胱氨酸?；瘜W合成法不僅步驟較多，而且得到的產物通常為外消旋體，需經拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。

馬云峰(CN?1876628A，2006)以DL-半胱氨酸為原料，以無機酸為溶劑，以D-二苯甲酰酒石酸或L-二苯甲酰酒石酸為拆分劑，將外消旋半胱氨酸與拆分劑按一定摩爾比溶于稀的無機酸溶液中，保溫攪拌、冷卻結晶，分別制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。

3、發酵法

目前發酵法生產L-半胱氨酸正處于實驗室探索階段，其主要問題是微生物體內的L-半胱氨酸合成過程復雜，且巰基來源難以解決。

張建國(CN?101831397A，2010)利用基因改造的大腸桿菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化鈉、硫代硫酸鈉等成分的培養基中發酵產生了L-半胱氨酸，基因改造前的大腸桿菌BL21(DE3)L-半胱氨酸產量幾乎為0，而基因改造后的BL21(DE3)L-半胱氨酸產量達到1g/L。

托馬斯·邁爾(CN?1262646C，2006)采用半胱氨酸代謝去調節、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等成分的培養基中補料分批發酵，流加葡萄糖及硫代硫酸鹽，發酵48h后發酵液中L-半胱氨酸含量達到22.6g/L。

Takagi?Hiroshi(EP1234874，2002)以棒狀桿菌為出發菌株，通過基因改造提高胞內絲氨酸乙酰轉移酶活性，同時降低半胱氨酸脫巰基酶活性，在含葡萄糖、硫酸銨等成分的產半胱氨酸培養基中發酵，積累了L-半胱氨酸和L-胱氨酸。

4、酶轉化法

自1979年Sano?K.等(Applied?and?Environmental?Microbiology，34(6)：806-810，1977)發現嗜硫氮雜環戊烯假單胞菌轉化DL-2-氨基-Δ²-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)為L-半胱氨酸以來，酶法生產L-半胱氨酸已成為近年來人們關注和研究的方向。酶法轉化因具有專一性強、反應條件溫和、環境友好等優點而日益受到重視。

日本具有用DL-ATC為原料酶法制備L-半胱氨酸較為成熟的生產工藝，國內學者也做了相關研究。王普(CN?100467587C，2009)以假單胞菌zjwp-14濕菌體或粗酶液為酶源，以DL-ATC為底物，于20～52℃酶促轉化1～9h，得到含L-半胱氨酸的反應液，經分離提取制得L-半胱氨酸。陳寧(CN?101348809A，2009)以惡臭假單胞菌(Pseudomonas?putida)TS-1138為供試菌種，以全細胞為酶源酶法轉化DL-ATC合成了L-半胱氨酸。

以DL-ATC為底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化學合成DL-ATC，且酶轉化過程中需要多步酶促反應，整體催化效率不高。

焦慶才等(Bioresource?Technology，102：3554-3557，2011)以L-絲氨酸和吲哚為底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pET-28a-trpBA/BL21)酶法合成了L-色氨酸。但據文獻報道色氨酸合成酶不僅能夠催化L-絲氨酸和吲哚合成L-色氨酸，還能催化L-絲氨酸和硫氫化鈉反應生成L-半胱氨酸。