[發(fā)明專利]兔軟骨下骨成骨細胞體外擴增培養(yǎng)方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110445679.1
• 申請日: 2011-12-28
• 公開（公告）號: CN102517250A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李秀蘭;張楊;郭悅;孫曉雷;張瑋;崔麗;馮俊奇
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市天津醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12Q1/02
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細胞體外擴增培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

技術(shù)背景

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種臨床常見的老年性退變性疾病，以關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙(包括關(guān)節(jié)畸形)為主要臨床表現(xiàn)。OA是以軟骨降解和軟骨下骨硬化為主要特征的骨再造，二者之間的聯(lián)系對提示骨細胞代謝活性的改變有著重要意義。OA治療時既應(yīng)關(guān)注軟骨變化，又要預(yù)防軟骨下骨退變。然而多年來的研究多數(shù)集中在軟骨病變上，軟骨下骨的研究甚少。Radin等首次提出軟骨下骨可能在軟骨退變的開始及進展中起關(guān)鍵作用。骨重塑異常引起的軟骨下骨硬化，使其失去作為一個“震蕩吸收器”的作用，從而使反作用于關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力增強，同時其釋放的因子通過生物學(xué)交流影響軟骨細胞的代謝，導(dǎo)致軟骨破壞【Amin?AK，Huntley?JS，Simpson?AH，Hall?AC.Chondrocyte?survival?in?articular?cartilage：the?influence?of?subchondral?bone?in?a?bovine?model.J?Bone?Joint?Surg?Br.2009，91(5)：691-9】。另外還有研究者提出軟骨下骨重塑可先于軟骨的退變，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的病變。Sanchez等對OA病人軟骨細胞進行體外培養(yǎng)，并與OA軟骨下骨硬化骨共培，發(fā)現(xiàn)硬化骨成骨細胞會阻礙軟骨細胞聚集蛋白多糖基因表達，卻促進金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-3及MMP-13表達，表明OA病人的軟骨下硬化骨成骨細胞可以刺激軟骨細胞產(chǎn)生MMP而引起軟骨降解，并抑制聚集蛋白多糖的合成【Sanchez?C，Deberg?MA，Piccardi?N，et?al，Subchondral?bone?osteoblasts?induce?phenotypic?changes?in?human?osteoarthritic?chondrocytes[J].Osteoarthritis?Cartilage.2005；13(11)：979-997.】。然而上述方法是通過骨組織與軟骨細胞共培完成，如果我們可以成功分離出軟骨下骨成骨細胞與軟骨細胞共培養(yǎng)，得到的結(jié)果無疑更有說服力。

軟骨下骨成骨細胞的分離、純化、體外大量擴增對于骨性關(guān)節(jié)炎的研究具有重要意義。骨性關(guān)節(jié)炎是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下，軟骨細胞、滑膜細胞、軟骨下骨成骨細胞及細胞外基質(zhì)降解合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。以滑膜細胞、軟骨細胞、軟骨下骨成骨細胞作為實驗對象，可以在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下，考察三種細胞間的相互影響，從細胞的角度去推斷骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展機制。同時，軟骨下骨成骨細胞具有普通成骨細胞的功能表達，亦可作為種子細胞參與骨組織工程的研究。

目前涉及到軟骨下骨的研究均是以生物力學(xué)及外科手術(shù)研究為主，生物學(xué)研究特別是細胞學(xué)水平的研究甚少。究其原因，除了骨性關(guān)節(jié)炎標準化模型制造困難，更重要的是骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細胞難以獲取。現(xiàn)報道的成骨細胞的培養(yǎng)方法主要有酶消化法和組織塊法，前者是將消化骨片后的細胞懸浮液離心后所得細胞接種于培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)，而后者是用骨片貼附培養(yǎng)【Pelletier?JP，Lajeunesse?D，Jovanovic?DV，et?al.Carprofen?simultaneously?reduces?progression?of?morphological?changes?in?cartilage?and?subchondral?bone?in?experimental?dog?osteoarthritis[J].J??Rheumatol2000；27：2893-2902.】。兩種方法對于實驗動物的顱骨或骨膜來源組織的消化均能得到一定量的成骨細胞，然而對于成年關(guān)節(jié)炎模型動物的軟骨下骨成骨細胞的分離效果鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種兔軟骨下骨成骨細胞體外擴增培養(yǎng)方法及應(yīng)用，通過利用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型，采用I型膠原酶消化聯(lián)合組織塊貼附法獲得軟骨下骨成骨細胞，所獲得的細胞純度高且增殖能力良好。本發(fā)明建立一種簡單、高效的軟骨下骨成骨細胞的制備方法。對研究OA發(fā)生、發(fā)展及其防治OA有重要意義。

本發(fā)明提供的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細胞是采用改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型，無菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)，于脛骨平臺下軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)獲取軟骨下骨骨片，通過酶消化聯(lián)合貼壁法獲得的。

本發(fā)明提供的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細胞的體外擴增培養(yǎng)方法包括如下的步驟：

1)制作改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型4～6周后，無菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)；