[發(fā)明專利]豬肌肉特異性MLC2啟動(dòng)子克隆鑒定與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110445351.X
• 申請(qǐng)日: 2011-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN102766629A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐德全;劉敏;孫小瑞;夏曉亮;劉倩;熊遠(yuǎn)著;蔣思文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于豬分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種豬肌肉特異表達(dá)基因MLC2啟動(dòng)子的克隆鑒定與應(yīng)用。

背景技術(shù)

肌球蛋白(myosin)，又稱ATP磷酸水解酶，作為一種分子馬達(dá)作用于肌動(dòng)蛋白(actin)，能有效地將高能磷酸化合物ATP分解釋放的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能，為肌肉收縮、細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞分裂等提供動(dòng)力，是肌肉組織中含量最高也是最重要的蛋白質(zhì)，約占肌肉總蛋白質(zhì)的1/3，占肌原纖維蛋白質(zhì)的50％～55％，為粗絲的主要成分(Vale?and?Milligan，2000)。肌球蛋白是一個(gè)大分子六聚體，由1對(duì)重鏈(α-MHC、β-MHC)及2對(duì)輕鏈(MLC)組成。2對(duì)輕鏈分別為可磷酸化的調(diào)節(jié)輕鏈(Regulatory?light?chain或DTNB輕鏈，LC2)和不可磷酸化的必需輕鏈(Essential?light?chain或堿性輕鏈，由LC1和LC2組成)，位于重鏈的頭部(Trybus?KM.The?role?of?myosin?light?chains.J?Muscle?Res?Cell?Motil，1994，15：587-594)。

MLC2(myosin?light?chain?2)編碼肌球蛋白輕鏈2，是肌球蛋白的重要組分(肌球蛋白的凝聚狀態(tài)以及熱誘導(dǎo)時(shí)的凝膠特性對(duì)肉制品的質(zhì)構(gòu)、脂肪和水的結(jié)合能力等有很大影響)，對(duì)肌球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能顯示重要調(diào)節(jié)作用，在肌肉的發(fā)生過(guò)程中起著調(diào)控重鏈表達(dá)的重要作用。MLC2屬于肌鈣蛋白C超家族，具有能與鈣離子結(jié)合的EF臂結(jié)構(gòu)域，能夠可逆的由肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶MLCP脫磷酸化和Ca²⁺/CaM依賴的肌球蛋白輕鏈激酶MLCK磷酸化，參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白互作、Ca²⁺敏感性、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和影響肌肉性能的其他相關(guān)參數(shù)。另外，MLC2也是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶的底物，能被有絲分裂因子活化蛋白激酶(MAPK)激活，參與多種細(xì)胞信號(hào)途徑。Davoli等(2003)已將其定位于豬的3號(hào)染色體短臂。徐德全等從雜交親代大白豬與子代長(zhǎng)大豬的背最長(zhǎng)肌的消減cDNA文庫(kù)中篩選到其EST，利用電腦克隆和SMART等技術(shù)，獲得了其cDNA全長(zhǎng)序列和全部?jī)?nèi)含子序列(GenBank登錄號(hào)分別為AY754870和AY870651，Xu?et?al.Identification?of?a?differential?gene?HUMMLC2B?between?F1?hybrids?Landrace×Yorkshire?and?their?female?parents?Yorkshire.Gene，2005，352：118-126)。

基因表達(dá)調(diào)控可以在復(fù)制、擴(kuò)增、基因激活、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后等多級(jí)水平上進(jìn)行。但基因的轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的基本控制點(diǎn)，最主要和最重要的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄起始階段(Trinklein?et?al.Identification?and?functional?analysis?of?human?transcriptional?promoters.Genome?Res.2003，13：308-312)。而轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的實(shí)質(zhì)是DNA-蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用對(duì)RNA聚合酶活性的影響，即通過(guò)影響相應(yīng)的反式作用因子與順式作用元件的相互作用，調(diào)控目的基因的表達(dá)。啟動(dòng)子是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的順式作用元件，含有基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要信息，基因表達(dá)的強(qiáng)度以及特異性很大程度上決定于它(Remenyi?et?al.Combinatorial?control?of?gene?expression.Nat?Struct?Mol?Biol.2004，11：812-815；Kim?et?al.Direct?isolation?and?identification?of?promoters?in?the?human?genome.Genome?Res.2005，15：830-839)。MLC2為肌肉特異表達(dá)基因。因此，分離克隆豬MLC2的啟動(dòng)子，研究其啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能和核心啟動(dòng)區(qū)的定位，是理解其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)最基本、最重要的內(nèi)容。利用其肌肉特異性啟動(dòng)子構(gòu)建更有效的基因工程表達(dá)載體，可強(qiáng)化轉(zhuǎn)基因表達(dá)的肌肉組織特異性和穩(wěn)定性，應(yīng)用于基因工程、育種工程等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于分離克隆與鑒定豬肌肉特異表達(dá)基因MLC2的啟動(dòng)子，應(yīng)用于豬遺傳改良的基因工程和育種工程等領(lǐng)域。

本發(fā)明克隆得到了豬MLC2基因5’端側(cè)翼1704bp的序列(啟動(dòng)子)，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示。