[發明專利]一種檢測乙型肝炎病毒DNA序列的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110445152.9
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102586472A
• 公開（公告）日: 2012-07-18
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種檢測乙型肝炎病毒DNA序列的方法及試劑盒。

背景技術

乙型肝炎是全球廣泛分布的傳染病，在世界上的許多國家呈現地域性分布，全世界有超過20億的人群感染過乙型肝炎病毒(hepatitis?B?virus，HBV)，其中有約3.5億人是慢性攜帶者。而中國是慢性乙型肝炎的重災區，超過8％的人口為慢性攜帶者。慢性乙型肝炎可引起肝硬化、肝功能衰竭、肝癌等嚴重的肝臟疾病，已經被WTO列為第9大死因。HBV基因組是不完整的雙鏈環狀DNA分子，約3200bp，由于HBV在復制過程中存在反轉錄過程，而其多聚酶或反轉錄酶缺乏糾錯能力，所以，在復制周期中HBV?DNA發生突變的頻率很高，且每個位點都可能產生任何形式的堿基改變，而HBV基因突變可能導致其對抗HBV藥物產生耐藥。因此，對HBV進行基因序列測定，得到其具體的序列信息，然后結合其他的研究(包括免疫學實驗、分子生物學實驗、臨床檢測等)有可能實現個性化醫療。

目前，檢測乙型肝炎病毒DNA序列的方法中，PCR產物直接測序法最為常見，它是基于雙脫氧測序技術(Sanger測序法)來實現的。它每次均只能對一個樣品的某一段HBV基因序列進行測序，檢測效率低，測序成本高，且由于sanger測序原理的限制，在檢測帶有雜合子的樣品的信號時會出現雙峰乃至多峰，導致測序所得的測序峰圖紊亂，甚至無法分析得到的序列信息，測序失敗。大量的研究已經證實，PCR產物直接測序法僅能于混合病毒群中檢測出比例≥20％的病毒，且無法得出發生突變位點的精確變異比例。而現有技術中基于Sanger測序法的試劑盒存在同樣的缺陷。

因此，需要一種檢測乙型肝炎病毒DNA序列的新方法和新試劑盒，能夠同時對HBV的多個目標區域進行檢測，提高了檢測效率，同時還能提高檢測的準確性和靈敏度，并能進一步同時對大量樣品進行檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測乙型肝炎病毒DNA序列的方法及試劑盒，能夠同時對HBV的多個目標區域進行檢測，提高了檢測效率，同時還能提高檢測的準確性和靈敏度，并能進一步同時對大量樣品進行檢測。

本發明是這樣實現的，一種檢測乙型肝炎病毒DNA序列的方法，包括以下步驟：

A.利用乙型肝炎病毒特異性引物，對待測樣品中的多個目標區域進行擴增，得擴增產物，并基于擴增產物構建測序文庫；

B.對測序文庫進行單分子擴增，得與所述多個目標區域對應的多個單分子擴增產物；

C.對所述多個單分子擴增產物同時進行高通量基因測序，得所述多個目標區域的序列信息。

其中，所述步驟A包括以下步驟：

A1.利用乙型肝炎病毒特異性引物，對待測樣品中的多個目標區域進行擴增，得與所述多個目標區域對應的擴增產物；

A2.將接頭元件與所述多個目標區域對應的擴增產物進行連接，得測序文庫；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環結構的接頭和分叉接頭中的至少一種。

其中，所述步驟A2包括以下步驟：

A21.對與所述多個目標區域對應的擴增產物進行片段化，得片段化產物；

A22.將接頭元件與所述片段化產物進行連接，構建測序文庫。

進一步的，步驟A所述的目標區域測序文庫的長度無特殊限制，優選為25bp～500bp。更優選為50bp～200bp，更優選為70bp～130bp。

其中，所述步驟A22包括以下步驟：

A221.利用第一接頭與片段化產物的兩端連接，得第一連接產物；

A222.環化第一連接產物，得環化產物；

A223.II?s型限制性內切酶酶切環化產物，得酶切產物；

A224.在酶切產物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測序文庫。

其中，所述步驟A22包括以下步驟：

A221’.利用第四接頭與片段化產物連接，得第二連接產物；

A222’.II?s型限制性內切酶酶切第二連接產物，得含第四接頭的酶切片段；

A223’.帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測序文庫。

其中，步驟A2所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標簽序列，該第一標簽序列，用于在文庫構建過程中，對不同待測樣品的測序文庫進行標記。該第一標簽序列，優選為帶有特定堿基序列的核酸分子，其堿基數不限。

進一步的，該第一標簽序列堿基數優選為3～20，更優選為4～10。