[發明專利]一種檢測嗜酒基因的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110445112.4
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102533991A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 盛司潼
• 申請（專利權）人: 盛司潼
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種檢測嗜酒基因的方法及試劑盒。

背景技術

飲酒會導致多種疾病，最常見的為酒精性肝病(alcoholic?liver?disease，ALD)。據統計，全世界約有1500萬-2000萬人酗酒，其中約10％-20％(150萬～400萬)有不同程度的酒精性肝病。在我國，隨著人民生活水平的不斷提高，經濟條件的改善，近年來ALD的發病率也呈逐年上升趨勢，酒精己成為繼病毒之后導致肝損傷的第二大原因。飲酒的健康危害主要由酒精(乙醇)及其中間代謝產物乙醛引起，兩者在體內的有效劑量水平和作用時間長短除與酒精攝入量，飲酒頻率相關外，還與體內的代謝酶活性相關。因此檢測與酒精代謝酶相關基因的序列信息，再結合其他的人體狀況檢測以及臨床觀察和實驗技術，可以對人體酒精代謝能力做出預判，從而提醒ALD易患人群改善生活習慣，達到預防的目的。

嗜酒基因是指初步研究可能與人體酒精代謝能力有關的基因。目前，檢測嗜酒基因的方法最常見的是利用PCR產物直接進行測序的Sanger測序法，該方法能對嗜酒基因進行區域檢測，但Sanger測序法每次只能對一個樣品的某一段區域進行測序，因此檢測效率低、成本高；而且由于sanger測序原理的限制，在檢測帶有雜合子的樣品信號時會出現雙峰乃至多峰，使得該樣品無法被準確識別出來，導致檢測靈敏度低(20％)。而目前市面上基于該方法形成的檢測試劑盒，存在同樣的缺陷。

因此需要一種檢測嗜酒基因的新方法和新試劑盒，能夠提高檢測效率，降低檢測成本；同時還能提高檢測的準確性和靈敏度。

發明內容

本發明的目的在于提供一種檢測嗜酒基因的方法及相應的試劑盒，能對嗜酒基因的多個目標區域同時進行檢測，提高檢測效率，降低成本，還能提高檢測的準確性和靈敏度。

為了實現發明目的，一種檢測嗜酒基因的方法，包括以下步驟：

A.利用嗜酒基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標區域進行擴增得擴增產物，并基于擴增產物構建測序文庫；

B.對測序文庫進行單分子擴增，得到與所述多個目標區域對應的多個單分子擴增產物；

C.同時對所述多個單分子擴增產物進行高通量基因測序，得到所述多個目標區域的序列信息。

其中，所述步驟A包括：

A1.利用嗜酒基因特異性引物，對待測樣品中的多個目標區域進行擴增，得到與所述多個目標區域對應的擴增產物；

A2.利用接頭元件，與所述多個目標區域對應的擴增產物進行連接，得到測序文庫；所述接頭元件采用平末端接頭、突出末端接頭、帶莖環結構的接頭和分叉接頭中的至少一種。

其中，步驟A2包括以下步驟：

A21.對與所述多個目標區域對應的擴增產物進行片段化，得片段化產物；

A22.利用接頭元件，與片段化產物進行連接，構建測序文庫。

其中，所述步驟A22包括以下步驟：

A221.利用第一接頭與片段化產物的兩端連接，得第一連接產物；

A222.環化第一連接產物，得環化產物；

A223.II?s型限制性內切酶酶切環化產物，得酶切產物；

A224.在酶切產物兩端接上第二接頭和第三接頭，得測序文庫。

其中，所述步驟A22包括以下步驟：

A221’.利用第四接頭與片段化產物連接，得第二連接產物；

A222’.II?s型限制性內切酶酶切第二連接產物，得帶有第四接頭的酶切片段；

A223’.帶有第四接頭的酶切片段與第五接頭連接，形成測序文庫。

其中，步驟A2所述接頭元件中的至少一個接頭包含有第一標簽序列，用于在文庫構建過程中，對不同待測樣品的測序文庫做上相應的標記。所述第一標簽序列，優選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數不限。

進一步的，所述第一標簽序列堿基數優選為3～20，更優選為4～10。

其中，步驟A所述的嗜酒基因特異性引物與目標區域完全互補或部分互補。

進一步的，與每個目標區域對應的特異性引物中，至少有一條引物與目標區域部分互補，且該引物的5’端帶有第二標簽序列，用于在擴增目標區域過程中，對不同待測樣品的目標區域擴增產物做上相應的標記。所述第二標簽序列，優選為帶有特定序列的核酸分子，其堿基數不限。

進一步的，所述第二標簽序列堿基數不限，優選為3～20，更優選為4～10。