[發明專利]一種假病毒載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201110445022.5
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102559731A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 吳紹強;鄧俊花;林祥梅;王彩霞
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12Q1/70;C12R1/92
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

1.一種假病毒載體，其特征在于，包括出發載體的啟動子序列和終止子序列，MS2噬菌體成熟酶蛋白基因編碼序列、突變的外殼蛋白基因編碼序列、部分裂解蛋白和復制酶基因編碼序列，出發載體一個末端的多克隆位點序列。

2.如權利要求1所述的假病毒載體，其特征在于，所述的突變的外殼蛋白基因編碼序列是在位于MS2噬菌體的外殼蛋白基因編碼序列的第15-16個氨基酸之間，插入6His標簽，核苷酸序列為CATCACCATCACCATCAC。

3.如權利要求1或2所述的假病毒載體，所述的出發載體為pTrcHis2A。

4.如權利要求3所述的假病毒載體，其為pTrcMS，核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

5.一種權利要求4所述假病毒載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在pTrcHis?2A載體多克隆位點的NcoI和BglII雙酶切位點處插入噬菌體MS2的基因片段，得到前假病毒載體pTrcHis-MS2；

2)通過基因插入方法將載體pTrcHis-MS2中外殼蛋白基因編碼序列的第15-16個氨基酸之間插入6His序列，構建得到假病毒載體；

3)假病毒載體pTrcMS用His柱進行純化。

6.如權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述步驟2)是以前假病毒載體pTrcHis-MS2為模板，以兩對含有突變基因的PCR引物對為引物，分別進行PCR擴增反應，回收純化擴增產物；用XhoI和Hind?III雙酶切前假病毒載體pTrcHis-MS2；兩次PCR的擴增產物與酶切后的pTrcHis-MS2連接，轉化受體菌，經篩選，誘導表達，鑒定得到假病毒載體pTrcMS。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的含有突變基因的PCR引物對，其核苷酸序列為：

Primer1-F：5’-AGGTAACATGCTCGAGGGCCTT-3’，

Primer1-R：5’-GACATCACCATCACCATCACACTGGCGACGTGGCTGTCGCCCCA-3’；

Primer2-F：5’-GTGTGATGGTGATGGTGATGTCCGCCATTGTCGACGAGAACG-3’，

Primer2-R：5’-GTTCGGGCCCAAGCTTCGAATTCCC-3’。

8.一種假病毒顆粒，其特征在于，含有權利要求4所述假病毒載體pTrcMS及其攜帶有外源基因的噬菌體基因組。

9.一種假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，將外源基因克隆于權利要求4所述假病毒載體pTrcMS中的MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，在其下游插入終止子，轉錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉錄本，誘導表達噬菌體外殼蛋白并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內，得到假病毒顆粒。

10.權利要求4所述的假病毒載體或權利要求8所述的假病毒顆粒在制備檢測動物病原微生物質控品的應用。