[發(fā)明專利]帶有熒光素酶標(biāo)簽的EV71型全長感染性克隆的制備方法及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110444376.8
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102559754A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張波;史佩勇;許文波;袁志明;鄧成林;商寶娣;賈凡
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種帶有Rluc標(biāo)簽的腸道病毒71型全長感染性克隆的制備方法，同時還涉及一種帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆在制備病毒的能力及藥物篩選中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腸道病毒71型(Enterovirus?71，EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為7.5kb，編碼約2200個氨基酸。基因組編碼的多聚蛋白可切割成3個前體蛋白(P1、P2、P3)。其中，P1前體蛋白可切割4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)。P2和P3前體蛋白可切割為7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)；P3區(qū)在進化過程中高度保守。ORF的兩側(cè)分別為5’和3’非編碼區(qū)，另外在3’非編碼區(qū)末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸(polyA)。

EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴重時可危及生命。其傳播途徑主要經(jīng)由胃腸道或呼吸道傳播，也可經(jīng)由接觸病人皮膚水泡的皰疹液而受到感染。自1974年，EV71被首次報道以來，已在馬來西亞、澳大利亞、新加坡、日本，中國臺灣和中國大陸等國家和地區(qū)爆發(fā)和流行。在我國，很多地區(qū)都曾有散發(fā)病例的報道，直到2008年EV71的爆發(fā)流行(手足口病病例488955例，死亡126例)，才引起了整個社會的關(guān)注。因此，2008年4月，國家衛(wèi)生部頒發(fā)了《腸道病毒(EV71)感染診療指南(2008版)》和《手足口病預(yù)防控制指南(2008版)》，并在同年5月將手足口病納入丙類法定傳染病管理。2009年，我國部分地區(qū)手足口病病例呈現(xiàn)增多的趨勢。針對嚴峻的現(xiàn)狀，廣大的科學(xué)工作者以EV71為對象，從病毒的生物學(xué)特性、致病機理、診斷試劑和疫苗的研究等方面做了大量的工作。但是，目前仍然缺乏特效的治療手段。因此，繼續(xù)深入的開展相關(guān)的研究，如病毒的分子生物學(xué)特性、復(fù)制機制、致病機理等，將有利于人類更加全面透徹的了解EV71，從而為設(shè)計有效的藥物、準(zhǔn)確的診斷方法和試劑以及良好的疫苗提供理論依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，科學(xué)家已經(jīng)能夠通過反向遺傳學(xué)的手段來定向改造病毒，為深入開展相關(guān)的病毒學(xué)研究提供了良好的工具。目前，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到了許多不同的病毒研究中，如西尼羅病毒，登革病毒，狂犬病毒，牛病毒性腹瀉病毒等，建立了相應(yīng)病毒的反向遺傳學(xué)平臺(全長感染性克隆)，以這些平臺為基礎(chǔ)開展了關(guān)于病毒的復(fù)制機制、致病機理和疫苗的相關(guān)研究，并取得了突破性的進展。同時，相關(guān)的科學(xué)工作者在構(gòu)建的全長感染性克隆的基礎(chǔ)上進一步的設(shè)計了帶有不同標(biāo)簽的全長感染性克隆。這一新的反向遺傳學(xué)平臺為開展相關(guān)的科學(xué)研究提供了相比于不帶標(biāo)簽的病毒全長感染性克隆更便捷的優(yōu)勢。

因此，本發(fā)明提供了一種帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆，為深入開展EV71的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供了有效的平臺。本發(fā)明具有十分重要的理論意義和現(xiàn)實意義，同時具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是在于提供了一種帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆的制備方法。通過該方法，可獲得帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆。將獲得的EV71全長感染性克隆體外轉(zhuǎn)錄為RNA，并將其轉(zhuǎn)染Vero細胞，通過細胞病變的觀察、Rluc活性的檢測和病毒蝕斑實驗證明了帶有Rluc基因的EV71全長感染性克隆具有穩(wěn)定產(chǎn)生EV71的能力，并且產(chǎn)生的EV71的生物學(xué)特性與親代病毒相似。

本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆在制備病毒的能力和藥物篩選中的應(yīng)用，EV71的感染能夠引起人的手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，嚴重時可危及生命。實驗證明，以構(gòu)建的帶有Rluc標(biāo)簽的EV71全長感染性克隆為平臺，使用已知對EV71具有抑制作用的鹽酸胍測試本發(fā)明所構(gòu)建的平臺在抗病毒藥物篩選中的有效性，結(jié)果表明本發(fā)明能夠很好的應(yīng)用抗病毒的藥物篩選。另外，本發(fā)明也在研究EV71的動物模型、病毒的復(fù)制機制與致病機理、藥物的作用機制、疫苗和診斷試劑的研發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種帶有Rluc標(biāo)簽的EV71型全長感染性克隆的制備方法，其步驟是：

1.總RNA的提取：