[發明專利]尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法

無效

• 申請號: 201110443651.4
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102443651A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: 劉必成;鄭敏
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京天翼專利代理有限責任公司 32112
• 代理人: 湯志武

技術領域

本發明屬于糖尿病腎病尿液生物標志物研究方法的建立，特別涉及一種基于SYBR?Green?I實時熒光定量PCR方法的尿液足細胞特異性信使核糖核酸(mRNA)檢測技術的構建。

背景技術

糖尿病腎病(Diabetic?nephropathy，DN)在西方發達國家是導致終末期腎衰(end-stage?renal?disease，ESRD)的首要病因。在我國，DN也是僅次于腎小球疾病而導致ESRD的第二位病因。DN的發病機制目前尚未完全闡明。足細胞是一類附著于腎小球基底膜上的高度分化的上皮細胞，參與維持濾過屏障的完整性。最近大量研究證實，足細胞損傷在DN發病及進展過程中發揮極為重要的作用。足突融合、足細胞肥大、凋亡、脫落，以及足細胞上皮間充質轉分化都是可能參與DN發展的機制。因此，檢測足細胞特異性表達的蛋白及基因已成為研究DN的一種方法。

目前，腎穿刺以及免疫組化技術是研究足細胞標志分子的常規方法，然而腎穿刺作為一項創傷性檢查，具有穿刺后出血、感染等不可避免的操作風險，且無法對患者進行連續動態觀察。因此，需求無創、動態監測患者足細胞特異分子表達改變的技術成為研究熱點。

實施熒光定量PCR(real-time?quantitive?PCR)作為一項成熟可靠的技術以其高靈敏度、高特異性及穩定性而廣發用于各項分子生物學研究。尿液中蘊藏著大量生物學信息且具有無創收集、標本處理相對簡便的優勢，而目前尚無基于real-time?PCR技術檢測尿液足細胞特異性mRNA方法構建的報道。

發明內容

本發明提供一種基于SYBR?GREEN?I實時熒光定量PCR技術的尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法。

本發明利用SYBR?GREEN?I實時熒光定量PCR技術，建立尿液足細胞相關mRNA(podocalyxin、CD2-AP)的檢測方法，評估其檢測范圍及穩定性。

本發明技術解決方案如下：

一種尿足細胞特異信使核糖核酸聚合酶鏈反應檢測方法，構建步驟為：步驟1、尿液標本的收集：留取晨尿200-300ml，將晨尿置于離心機上并在離心力為3000g、溫度4℃下，離心30分鐘，棄上清，細胞沉渣重新懸浮于1ml焦碳酸二乙酯-PBS緩沖液(焦碳酸二乙酯與PBS緩沖液按體積比1∶1000配制)，得到懸浮液，將懸浮液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4℃下，離心5分鐘，棄上清，剩余沉渣中加入1ml?RNAiso?Plus，充分混勻，得到沉渣與RNAiso?Plus的混合液；步驟2、總RNA提取步驟：步驟2.1將所述沉渣與RNAiso?Plus的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4℃下，離心5分鐘，吸取上清液，轉入新的離心管；步驟2.2向由步驟2.1獲得的上清液中加入200ul氯仿，蓋緊離心管，劇烈振蕩15秒，待溶液充分乳化且分層現象消失后，再室溫靜置5分鐘，得到混懸液；步驟2.3將步驟2.2得到的混懸液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4℃下，離心5分鐘；步驟2.4取出離心管，吸取上清液轉移至另一新的離心管中；步驟2.5向由步驟2.4得到的上清液中加入等體積異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30℃下靜置10分鐘，得到混合液；步驟2.6將步驟2.5得到的混合液置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4℃下，離心5分鐘；步驟2.7棄去上清，沿離心管壁加入體積濃度為75％的乙醇1ml，上下顛倒洗滌離心管，置于離心機上并在離心力為12000g、溫度4℃下，離心5分鐘后棄去乙醇，得到RNA沉淀；步驟2.8室溫干燥RNA沉淀2-5分鐘，加入30ul?Rnase-free水，用移液槍吹打RNA沉淀并使其溶解，得到RNA溶液，再利用紫外分光光度計測定RNA濃度及純度；步驟3、逆轉錄：反應體系：1ug步驟2.8所述的RNA溶液，4ul?5X?PrimeScriptTM?Buffer，1ul?PrimeScriptTM?RT?Enzyme?Mix?I，1ul?Oligo?dT?Primer，1ul?Random?6mers，dH2O混勻至20ul，將反應體系升溫至37℃，反應15分，再繼續升溫至85℃，反應5秒，逆轉錄生成的cDNA置于-20℃保存；步驟4、引物設計與合成：podocalyxin：forward?5’-CTTGAGACACAGACACAGAG，reverse?5’-CCGTATGCCGCACTTATC；CD2-AP：forward?5’-AGGCTGGTGGAGTGGAAC，，reverse?5’-CAGAGAAGGTATAGGTGAAGTAGG；β-actin：forward?5’-TGGCACCCAGCACAATGAA，reverse?5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；步驟5、實時熒光定量PCR反應：PCR反應體系：2ul由步驟3得到的cDNA，10ul?SYBR?Premix?Ex?TaqTM，0.4ul正義引物，0.4ul反義引物，0.4ul?ROX?Reference?dye??以及6.8ul?dH2O，采用兩步法進行PCR擴增：①將PCR反應體系加熱至95℃，反應30s，②在95℃下反應5s后降溫至60℃反應31s，并以95℃下反應5s后降溫至60℃反應31s為一個循環，如此擴增40個循環，最后建立熔解曲線(dissociation?curve，DC)并鑒定產物特異性；步驟6、準標準品制備及準標準曲線制作：將步驟5獲得的反應產物進行10倍梯度稀釋后得到不同濃度的準標準品，將不同濃度的準標準品作為模板分別加入PCR反應體系進行PCR擴增，用準標準品濃度和Ct值制作準標準曲線；步驟7、如果準標準曲線的線性相關系數大于0.99，則將準標準品作為標準品，并進入8，否則，返回步驟6；步驟8、將待檢測尿液進行步驟1～3的處理，得到待測cDNA，再分別對待測cDNA和步驟7得到的標準品進行步驟5所述的實時熒光定量PCR反應，制作標準曲線并根據標準曲線計算待測cDNA中各基因的含量，并與待測cDNA內參基因含量進行校正，最終得出各基因表達量。