[發明專利]一種利用點突變進行構建的基因工程能源微生物

無效

• 申請號: 201110443622.8
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102994390A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 范文俊;鄭曉光
• 申請（專利權）人: 浙江齊成碳能科技有限公司
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12P7/06;C12N15/74;C12N9/88;C12N15/60;C12R1/89
• 代理公司: 北京漢昊知識產權代理事務所(普通合伙) 11370
• 代理人: 黃可峻

1.一種利用光合作用生產乙醇的基因工程藍藻，其含有整合到染色體上的外源基因，所述外源基因為丙酮酸脫羧酶基因，所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQ?ID?NO.1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，優選突變為酪氨酸(Tyr)。

2.權利要求1所述的基因工程藍藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQ?ID?NO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQ?IDNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變為編碼酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列，優選其中所述編碼對應于SEQ?ID?NO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優選替換為ACC。

3.權利要求1或2所述的基因工程藍藻，其中所述丙酮酸脫羧酶基因選自來源于運動發酵單胞菌、釀酒酵母、藍藻和大腸桿菌的丙酮酸脫羧酶基因，優選來源于運動發酵單胞菌。

4.權利要求中1-3中任一項的基因工程藍藻，其選自集胞藻屬、隱球藻屬、魚腥藻屬、念珠藻屬、顫藻屬、聚球菌屬、球藻屬、阿格藻屬、雙歧藻屬、鞭枝藻屬，優選為集胞藻，最優選為集胞藻PCC6803。

5.權利要求1-4中任一項的所述的基因工程藍藻，其生產的乙醇由細胞中擴散到培養液中，溶液中乙醇濃度達到0.1g/L，優選的，達到0.5g/L，更優選的，達到1.5到5g/L。

6.權利要求1-5任一項的基因工程藍藻，其保藏號為CGMCC?No.5532。

7.用權利要求1-6中任一項的基因工程藍藻制備乙醇的方法。

8.一種載體，其包括：

(a)核酸，其包含丙酮酸脫羧酶基因，其中所述丙酮酸脫羧酶基因編碼的丙酮酸脫羧酶具有對應于SEQ?ID?NO?1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變；

和

(b)啟動子，所述啟動子與所述丙酮酸脫羧酶可操作地連接，

其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，優選其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)，

優選的，

其中所述丙酮酸脫羧酶基因具有SEQ?ID?NO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQ?ID?NO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變為編碼酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列，優選其中所述編碼對應于SEQ?ID?NO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優選替換為ACC。

9.一種分離的蛋白，其具有丙酮酸脫羧酶的活性，其具有對應于SEQ?ID?NO?1的氨基酸序列，并且其中自N端第290位的蘇氨酸Thr具有突變，其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)，最優選其中所述第290位的蘇氨酸Thr突變為酪氨酸(Tyr)。

10.一種分離的核酸，其編碼權利要求9所述的蛋白，所述核酸為具有SEQ?ID?NO.2的堿基序列的多核苷酸，并且其中編碼對應于SEQ??DNO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC改變為編碼酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)的堿基序列，優選其中所述編碼對應于SEQ?ID?NO.1氨基酸序列中自N端第290位的蘇氨酸的堿基序列由TAC替換為ACC、ACA、ACT或ACG，優選替換為ACC。