[發明專利]藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法

無效

• 申請號: 201110442613.7
• 申請日: 2011-12-27
• 公開（公告）號: CN102533670A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 彭廣能;梁璐琪;鐘志軍;符華林;卿佰春;王英柱;李思琪;舒龍;張恒;魏勝男
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，屬于病毒學技術領域。

背景技術

藏獒生活在青藏高原，已有3000多年的育成歷史，主要分布于我國西部地區的西藏、青海和四川等省區，不僅是我國特有的珍貴犬種，而且也是我國人民引以驕傲和自豪的保種動物。所以目前在所有品種的犬中只有藏獒的價格高居不下。盡管藏獒經歷了漫長的自然和人工選擇以及嚴酷的生存環境使藏獒具備了非一般犬所具備的智力、體能、適應性和抗病力，但是近年來，犬細小病毒(Canine?parvovirus，CPV)對藏獒特別是藏獒幼犬的感染和危害越來越嚴重，其發病率和死亡率比一般的犬種更高，成為當前危害藏獒養殖業最嚴重的傳染病。雖經注射過國產疫苗或進口疫苗，但仍有部分藏獒得不到有效保護，甚至有一些患犬久治不愈最終死亡。這不僅使許多藏獒養殖戶經濟上蒙受巨大的損失，而且導致藏獒的保種與市場開發受到極大的挑戰。目前國內外對CPV分離鑒定的報道很多，但藏獒源CPV的分離鑒定卻鮮有報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法。

藏獒源犬細小病毒的分離鑒定方法，包括以下步驟：

A1、病料采集與處理：臨床上經CPV膠體金試紙檢測為陽性的藏獒，將滅菌棉簽伸入發病藏獒肛門，擦拭直腸壁，沾取腸黏膜上皮，將棉簽頭置于1.5ml?EP管，加入無血清的DMEM至1ml；反復凍融3次，每次化凍后在振蕩器上振蕩1-2min后再進行下一次凍融；凍融后將液體轉入15ml離心管中，用無血清DMEM反復沖洗、振蕩棉簽頭3-4次，并將沖洗后的液體也轉入離心管中，最后加無血清DMEM至10ml，制成10％混懸液；8000rpm離心10-15min；取上清液，0.22um微孔濾膜過濾后，置于-20℃備用；

A2、病毒分離：10％混懸液按1∶30-1∶60同步接毒F81細胞，加入含15％FBS的DMEM后，置于37℃、5％CO₂中2-4h，換液，PBS蕩洗細胞1-2次，加15％DMEM，繼續培養24h；每天觀察細胞，配制含FBS?15％和5％的DMEM，根據細胞生長情況及時改變FBS的濃度；長滿一層后仍不出現CPE，按常規方法傳代，如傳至第5代仍無CPE，則視為病毒分離陰性；細胞若出現大面積CPE時收細胞和上層培養液，反復凍融3次，10000rpm，離心10-15min；取出上清，調節PH值到7.2-7.5，加入乙二醇至最終濃度為8％(w/v)；置于4℃中2h后，11000rpm，濃縮2h，加入少量無血清DMEM溶解病毒團塊，置于-20℃中備用；

A3、PCR鑒定；根據GenBank上公布的CPV的VP2核酸序列分別設計擴增VP2片段的特異性引物一對：P1、P2；擴增VP2全基因的特異性引物一對：P3、P4；擴增的目的片段大小分別為825bp和1755bp；由上海Invitrogen公司合成，引物序列為：

上游引物P1：5’-AACGGATGGGTGGAAATCAC-3’；

下游引物P2：5’-TAATAGTAGCTTCAGTAATA-3’；

上游引物P3：5’-CCAATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGAC-3’；

下游引物P4：5’-AATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGA-3’。

本發明從8份患病藏獒的直腸棉拭子中成功分離到6株CPV，分析比對其VP2全基因序列，均為CPV-2a。1978年首次發現CPV至今已有CPV-2，CPV-2a，CPV-2b，CPV-2c等亞型，國內CPV仍以CPV-2a流行為主。病毒由CPV-2進化為CPV-2a是由于VP2上四個氨基酸殘基位點(L87M，I101T，A300G，D305Y)發生了變異，本次分離的6個毒株在上述四個位點的變異情況與CPV-2a的相同，說明CPV在藏獒中的流行情況與在國內的流行情況一致。

本發明嘗試了用直腸棉簽拭子法采樣，既能保證樣品的新鮮度、減少污染，又能及時采到樣品、節約采樣時間。

附圖說明