[發(fā)明專利]NNMT蛋白單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110441596.5
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102618501A
• 公開（公告）日: 2012-08-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鈞;謝鑫友;楊肅文;王燕忠
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/40;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株、單克隆抗體，以及單克隆抗體在制備檢測尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的試劑盒中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織最新數(shù)據(jù)顯示，到2020年前，每年將新增1500萬癌癥患者，不僅如此，癌癥的死亡人數(shù)也在全球迅速上升，2007年全球共有760萬人死于癌癥，2030年這個數(shù)字可能會增至1320萬。

腫瘤的早期診斷是腫瘤防治的關(guān)鍵，腫瘤的死亡和復(fù)發(fā)的危險性與初診時的分期密切相關(guān)，且化療、放療的敏感性一定程度上取決于癌細胞內(nèi)的酶或蛋白分子。生物標志物是細胞處于特定條件下代表該細胞生物學(xué)狀態(tài)的重要信號指示分子。為了降低腫瘤的死亡率或提高治療的效果，許多研究致力于腫瘤關(guān)鍵生物標準物的發(fā)現(xiàn)和篩選。因此，尋求腫瘤早期診斷、分期或/和指示化療、放療的敏感性、預(yù)后以及潛在治療靶點的腫瘤標志物一直是腫瘤學(xué)的研究熱點。

尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT，EC2.1.1.1)正是今年用蛋白助學(xué)和基因芯片技術(shù)比較不同癌組織和癌旁組織差異時發(fā)現(xiàn)的癌組織中異常表達的蛋白質(zhì)酶。與正常組織和癌旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細胞癌、口腔鱗狀細胞癌和胰腺等腫瘤組織有過表達，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研究提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，推測NNMT可能參與腫瘤細胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響華、放療效果。

NNMT正常表達于人肝臟組織中，其他組織如腸、肺、腎、胎盤、心臟、骨骼肌、腦、胰腺表達很低或者沒有表達。NNMT在不同人的肝臟中活性差異較大，活性的高低取決于胞漿中NNMT的濃度，NNMT的濃度與NNMT的mRNA水平有關(guān)，與基因的多態(tài)性無關(guān)，通常認為NNMT過表達的機制是由于基因翻譯后調(diào)控異常所致，可能受肝細胞核因子-1(HNF-1)、TGF-β1、STAT3等激活。

NNMT的主要功能是以S-腺苷-L蛋氨酸(SAM)為供體，催化尼克酰胺和吡啶類物質(zhì)的甲基化，形成吡啶鹽，在正常肝細胞中參與藥物的生物轉(zhuǎn)化，是催化藥物、異型生物質(zhì)代謝的一種酶。NNMT是維持尼克酰胺平衡的關(guān)鍵酶，所以可以推測NNMT的增高可影響尼克酰胺參與細胞的功能。尼克酰胺是NAD分子的組成部分，可通過補救合成途徑生產(chǎn)NAD，而NAD參與細胞的很多基本可能如能力代謝，對應(yīng)和損傷的抵抗，細胞的壽命等。帕金森綜合癥被認為與NNMT增高引起的尼克酰胺代謝異常有關(guān)，在腦組織中該酶活性過度增高通過兩條途徑導(dǎo)致帕金森綜合癥，一是生成神經(jīng)毒物N-甲基吡啶(如N-甲基-4苯基吡啶(MPP+))激活導(dǎo)致線粒體復(fù)合體1受損，二是降低了尼克酰胺導(dǎo)致能量代謝障礙。尼克酰胺還能抑制多聚ADP聚合酶(PARP)，而PRAP通過堿基切除修復(fù)、壞死、凋亡等多細胞調(diào)節(jié)來保持基因組的完整性。因此有理由推測NNMT可能參與腫瘤細胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響化，放療效果。如能明確NNMT在腫瘤細胞中的作用，并闡明NNMT在腫瘤中的作用機制或分析其下游相關(guān)分子組成的模塊或通路，必將進一步明確NNMT作為在腫瘤防治中的價值。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種能穩(wěn)定高效分泌抗NNMT蛋白的抗體的雜交瘤細胞株，以及該細胞株分泌的單克隆抗體及應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞株1E7，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼：430072，保藏日期：2011年8月31日，保藏編號：CCTCC?NO：C?201167。該細胞株由尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白作為免疫原免疫小鼠后，篩選獲得。

本發(fā)明還涉及一種由所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體(1E7)。

經(jīng)檢測，所述單克隆抗體為IgG亞類、2aκ輕鏈型。

本發(fā)明還涉及所述的單克隆抗體在制備檢測尼克酰胺-N-甲基化酶蛋白的試劑盒中的應(yīng)用。

由于本發(fā)明的單克隆抗體對于NNMT蛋白均有高水平的抗體效價，因此本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性變異體，或其任意組合可用于制備用于檢測NNMT蛋白的試劑、藥劑或試劑盒。所述試劑、藥劑或試劑盒可用于檢測NNMT蛋白，從而可以進一步用于診斷、治療和預(yù)后判斷NNMT相關(guān)腫瘤。