[發(fā)明專利]利用微型膜保護(hù)透析技術(shù)測定生物樣品中的活性成分

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110441242.0
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102539560A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹小英;江一帆;李進(jìn)進(jìn);羅杠;馬興霞;沙碧瑩;游菁菁
• 申請（專利權(quán)）人: 江西中醫(yī)學(xué)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/08
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬藥物分析領(lǐng)域，涉及體內(nèi)生物樣品的分析測定方法，具體涉及一種利用多孔高分子材料膜制成的微型裝置對基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)合高效液相色譜法對富集濃縮后的目標(biāo)成分進(jìn)行測定的方法。?

背景技術(shù)

?（1）目前，國內(nèi)外對于體內(nèi)樣品測定前的預(yù)處理通常都是采用常規(guī)的蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等方法，這些方法存在靈敏度低，操作繁瑣費(fèi)時、效率低、有效成分損失較多、蛋白沉淀不完全等種種缺點(diǎn)。而血樣中的成分含量往往較低，運(yùn)用常規(guī)方法處理后提取回收率低，低濃度的活性成分可能因此而難以檢測到。一些聯(lián)用技術(shù)因高靈敏度低檢測限應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析，如HPLC-MS-MS等，但儀器價格昂貴難以推廣應(yīng)用。故建立提取效率高、簡單快捷、適用的微量生物樣品檢測方法對藥效學(xué)、藥代動力學(xué)研究有著重要的科學(xué)價值。

??（2）本發(fā)明將多孔聚合物膜制備成微型裝置，生物樣品置于裝置內(nèi)，采用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行透析，由于目標(biāo)小分子可以自由穿過膜孔，大分子的干擾物質(zhì)如蛋白質(zhì)等不能穿透膜孔而被滯留于膜袋內(nèi)，在恒溫振蕩器的振蕩下，目標(biāo)成分快速擴(kuò)散并溶于膜外的溶劑中達(dá)到平衡，該方法實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)的去除與目標(biāo)成分的富集同步進(jìn)行，提取分離效率高，成本低廉，操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)，可用于多種生物樣品中低濃度活性成分的檢測。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的不足，提供一種簡便、快捷、靈敏的測定體內(nèi)活性成分濃度的方法。?

本方法無需昂貴的儀器和試劑，具有操作簡單、快速、樣品用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合于常規(guī)生物樣品含量濃度測定。?

本發(fā)明通過以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體包括步驟如下：?

（1）將孔徑為0.22?μm的聚丙烯膜或聚醚砜膜采用塑封機(jī)熱封制成1.5cm×1cm的長方形膜袋；

（2）取適量的脫脂棉用去離子水潤濕，以濾紙將多余的水分吸掉后，將脫脂棉填充到膜袋底部作為載體；

（3）精密吸取100?μL待測樣品（如血漿、組織液、尿液等樣品），加載于載體上，然后將膜袋口密封；

（4）將制備好的料袋放入裝有4?mL提取溶劑的具塞試管中，再將試管置于恒溫振蕩儀中振蕩30?min；

（5）將料袋取出，將剩余洗脫液用氮?dú)獯蹈?，再用甲醇或流動相將剩余殘?jiān)ㄈ葜?.5?mL；

（6）將所得溶液用0.22?μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜法對其中所含的活性成分進(jìn)行含量測定。

以測定大鼠血漿樣品中金絲桃苷和異槲皮素為例，與常規(guī)前處理方法相比，本發(fā)明方法快速簡便、靈敏度高，最低檢測限達(dá)到0.20?μg/mL，有更高的絕對回收提取率，見表一。從表一中數(shù)據(jù)表明，本方法的絕對回收率高于其它常規(guī)預(yù)處理方法。常規(guī)方法的前處理方法如下：?

C₁₈固相萃取法：將C₁₈-SPE萃取柱（規(guī)格：100?mg?，1?mL）安裝于真空固相萃取裝置上，用5?mL甲醇、5?mL水依次活化平衡萃取小柱，精密吸取100?μL血漿樣品上柱，棄去濾液，用5?mL水除雜質(zhì)后，再用5?mL?80%甲醇淋洗，收集甲醇洗脫液，用N₂吹干，殘留物用80%甲醇定容至0.5?mL，過0.22?μm微孔濾膜后20?μL進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量。

蛋白沉淀法：精密量取血漿樣品100?μL，加入甲醇300?μL，渦旋1?min后，于4℃下以10000?r/min的轉(zhuǎn)速離心10?min，取上清液；再將沉淀下來蛋白加甲醇1?mL，渦旋1?min，4℃下以10000?r/min的轉(zhuǎn)速離心10?min取上清液，重復(fù)此操作兩次。合并三次清液，用N₂吹干吹干，殘留物用80%甲醇定容至0.5?mL，過0.22?μm微孔濾膜后取20?μL進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量。?

液液萃取法：?精密量取血漿樣品100?μL，加入氯仿-異丙醇混合溶液（v/v=1:1）2?mL?進(jìn)行萃取，然后于4℃下以10000?r/min的轉(zhuǎn)速離心10?min，取上清液，重復(fù)此萃取操作3次，合并清液，用N₂吹干，殘留物用80%甲醇定容至0.5?mL，過0.22?μm微孔濾膜后取20?μL進(jìn)樣，用外標(biāo)法定量。?

??????表一、?四種不同前處理方法富集同一血漿樣品中待測物的絕對回收率的比較。?

附圖說明：