[發明專利]一種補體系統激活水平的ELISA檢測方法

無效

• 申請號: 201110441180.3
• 申請日: 2011-12-24
• 公開（公告）號: CN103175951A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 力弘;章蘊毅;吳牧鷺;陳道峰
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于免疫學檢測方法領域，具體涉及一種藥物影響補體系統三條激活途徑激活水平的ELISA檢測方法。

背景技術

現有技術公開了補體系統包括30余種組分，廣泛分布于人和脊椎動物的血清、組織液和細胞膜表面，是具有精密調控機制的蛋白質反應系統。補體不僅是機體固有免疫防御的重要組成部分，也是抗體發揮免疫效應的主要機制之一。研究顯示，補體系統的正常活化可介導防御微生物感染和炎癥應答，但是其非正常活化會導致機體的嚴重損傷。臨床上觀察補體的動態變化，對一些疾病的診斷、病因研究等有重要的意義。多種疾病如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、免疫復合物引起的腎炎、急性肺損傷，缺血再灌注引發的組織損傷及同種異體器官移植排異反應等均涉及補體系統過度激活。建立快速和高效補體抑制劑篩選平臺，對急、慢性炎性疾病的治療有著重要的意義。

研究顯示，多種微生物成分、抗原-抗體復合物以及其他外源性或內源性物質可循三條既獨立又交叉的途徑，即經典激活途徑、替代激活途徑和甘露糖激活，通過啟動一系列絲氨酸蛋白酶的級聯酶解反應而激活補體，所形成的活化產物具有調理吞噬、溶解細胞、介導炎癥、調節免疫應答和清除免疫復合物等生物學功能。其中，補體成分C3是三條激活途徑的共同節點，C3被激活后裂解成C3a和C3b兩個片段，隨后大片段C3b可以進一步裂解成C3c和C3d，其中較大片段C3c為較穩定的裂解產物，并且可以與激活物相連接。

現有補體系統檢測手段主要是溶血試驗和補體缺失血清試驗，以及酶聯免疫吸附測定實驗。其中，溶血試驗應用最為廣泛。

溶血試驗是目前最常用的檢測方法。三條補體激活途徑所介導的終產物均為膜攻擊復合物，具有溶解能力，可以反映補體的功能，因此常采用補體溶血試驗測定經典途徑或替代途徑的總補體活性。補體溶血反應是基于抗紅細胞血清與紅細胞結合后，遇到補體即可使紅細胞發生溶血這一特點所建立的。具體方法是將抗紅細胞抗體與紅細胞結合，制成致敏紅細胞，然后用致敏紅細胞去檢測補體活性。羊紅細胞可以測定經典激活途徑，兔紅細胞可以測定替代激活途徑。對補體系統中任何一級的抑制均可導致部分或全部激活級聯反應受阻斷，但溶血試驗只能反映血清或體液中總的補體活性大小，無法準確定位藥物作用靶點。此外，膜攻擊復合物在進攻紅細胞使其裂解時并非一一對應，即一個紅細胞的裂解可能是由一個膜攻擊復合物引起的，也可能是由多個膜攻擊復合物引起的，因此，紅細胞的裂解量并不能準確地反映補體系統的激活水平。目前，溶血試驗無法對甘露糖途徑的激活水平進行測定。

在補體缺失血清試驗中，首先將一定濃度的藥物與一定濃度補體混合使其恰好完全抑制補體溶血，再補充不同成分補體缺失血清，若藥物作用部位恰好為這一缺失成分，則體系依然不溶血；反之，體系溶血。這一方法可用于確定藥物在補體激活體系中的作用位點，但是補體缺失血清大多需自行制備，步驟繁瑣復雜，且工作量大，研究速度緩慢。如果直接購買補體缺失血清，試劑昂貴。同時，這種方法無法研究藥物對補體系統的非特異性作用或半溶血作用，存在一定缺陷。

ELISA是酶聯免疫吸附測定試驗的簡稱，它是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的實驗技術。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的相應抗體或抗原既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，使其通過反應結合在固相載體上。此時，固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。

國外有文獻報道，將ELISA方法應用于血清中補體水平的檢測，該方法是針對經典途徑、替代途徑和甘露糖途徑三條激活途徑，分別用IgM、LPS和甘露糖三種激活物包被高吸附性酶標板，封板后加入含補體的血清，以地高辛連接的抗C3抗體為一抗，捕捉血清中的C3片段，以HRP連接的羊抗地高辛抗體為酶標檢測抗體，建立檢測補體水平的ELISA方法，并主要應用于患者體內補體水平的測定。

發明內容

本發明目的在于，基于ELISA原理，提供一種新的測定補體系統三條激活途徑激活水平的方法，并用于補體抑制劑的高通量篩選。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：