[發明專利]一種絲狀真菌啟動子和包含該啟動子的質粒

有效

• 申請號: 201110440901.9
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102559678A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 盧建平;張莉林;李海嬌;林福呈
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N15/80;C12N1/15
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種絲狀真菌啟動子和包含該啟動子的質粒。

背景技術

稻瘟病菌(Magnaporthe?oryzae)是一種研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的絲狀真菌模式生物，具有許多病原真菌共有的植物致病侵染循環，包括孢子產生、萌發、附著胞形成、侵染栓形成、侵入菌絲生長等致病過程。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界性的一種水稻上的毀滅性病害。世界上每年由稻瘟病造成的水稻產量損失在10～30％之間；我國幾乎每年都有稻瘟病菌的流行爆發。許多發達國家正在進行研究其致病分子機制，期望通過此類研究開發具有抗瘟特征的水稻品種，以及開發、設計新型抗真菌藥物。

稻瘟病菌的致病過程是一個復雜的分子過程。目前已經克隆了許多與稻瘟病菌致病性相關的基因，如：MPG1、CPKA、PMK1、MAGB、PLS1、SMO1、PDE1、MPS1、PTH11、CBP1、ICL1、BUF1、ALB1、ACR1、RSY1、HEX1、ATG1、MNH6等。盡管如此，稻瘟病菌的分子致病機制還不是很清楚，絕大多數的基因功能還未知。

鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，尤其是與侵入過程相關的基因，可以為開發具有抗瘟特征的水稻品種，以及設計、篩選抗真菌藥物提供有用的參考。目前根據稻瘟病菌無毒基因和水稻抗病基因的互作關系，選育了很多水稻抗瘟品種；也已經在包括稻瘟病菌在內的一些真菌中證明了一些藥物的靶點，如三環唑是一種很重要的稻瘟病菌殺菌劑，其作用是抑制黑色素的合成，靶點是稻瘟病菌的三羥萘還原酶；多肽殺菌劑sorphen?A的作用靶點是青霉的脫甲基酶(CYP51)。

鑒定、克隆植物病原真菌的致病性基因，需要分析蛋白在細胞內的定位、蛋白過量表達對植物病原真菌的作用等，這都需要一種絲狀真菌細胞內蛋白快速表達和高效表達的系統。在工業用絲狀真菌中，開發了構巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)的啟動子、產黃青霉的異青霉N-合酶基因啟動子、康氏木霉和微紫青霉的Cbh1啟動子、產黃頭孢的寬光譜脂肪酶基N(cesB)的啟動子等各種啟動子。但在絲狀病原真菌中，目前每個基因研究還都需要各自建立一個基因表達系統(如NAR啟動子；RP27啟動子)。公開號為CN102154294A的發明專利申請公開了一種絲狀真菌啟動子、終止子和包含它們的質粒，但該啟動子驅動蛋白在稻瘟病菌中的表達、定位效果仍不理想，需要探索更加高效、通用的絲狀真菌蛋白表達系統。

發明內容

本發明提供了一種絲狀真菌啟動子，利用該啟動子可以在絲狀真菌的菌絲、分生孢子、附著孢等各個階段高豐度表達蛋白、DNA或RNA。

一種絲狀真菌啟動子，所述的絲狀真菌啟動子或其互補鏈具有如SEQ?ID?NO.1所示的堿基序列，該絲狀真菌啟動子命名為H3啟動子。

本發明提供了包含上述絲狀真菌啟動子的質粒。

優選地，所述質粒的原始載體為pCAMBIA1300，pCAMBIA1300載體含有卡那霉素抗性基因。以pCAMBIA1300載體作為基本構架，獲得的穿梭表達載體可以通過農桿菌介導的方法直接轉化絲狀真菌，縮短了基因操作流程和時間，使用非常方便，具有較高的工作效率。

所述的質粒可以包含RP27終止子，RP27終止子或其互補鏈具有如SEQ?ID?NO.2所示的堿基序列。公開號為CN102154294A的發明專利申請公開了該終止子的獲得方法。

所述的質粒可以包含抗性基因，作為抗性篩選標記。所述的抗性基因為磺胺嘧啶抗性基因或新霉素抗性基因。

所述的質粒可以包含綠色熒光蛋白基因或紅色熒光蛋白基因。

本發明提供了所述質粒在絲狀真菌中表達蛋白、DNA或RNA中的應用。試驗結果顯示，利用該質粒能實現蛋白、重組蛋白或融合蛋白在絲狀真菌中的快速、高效表達或準確定位。

本發明還提供了包含所述質粒的轉化子。

本發明提供的絲狀真菌啟動子是一個強啟動子，在稻瘟病菌的菌絲、孢子和附著胞階段都能高強度啟動。該啟動子基因屬于表達強度在稻瘟病菌細胞內穩定在前100位以內的基因。該基因是組蛋白基因，對于維持細胞的正常運轉具有重要作用。

利用本發明提供的絲狀真菌啟動子，能夠構建在絲狀真菌中快速、高效表達的系統，從而便于研究蛋白在病原真菌細胞內的定位、蛋白過量表達對病原真菌的影響等。

附圖說明