[發明專利]亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因及其應用

有效

• 申請號: 201110440659.5
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN103173473A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 楊青;周罡;楊君;姜秀萍;劉田
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/24;C12N15/63;C12N15/70;C12N1/21;A01N61/00;A01P7/04;A61K45/00;A61P3/10;A61P25/28;C12R1/19
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因、含有該基因的表達載體的構建、該基因在原核宿主細胞中的蛋白表達及其應用。?

背景技術

隨著技術的發展，越來越多的O-GlcNAc修飾的蛋白被發現。其中，dbOGAP數據庫(http://cbsb.lombardi.georgetown.edu/OGAP.html)提供了來源不同物種的經O-GlcNAc修飾的蛋白及其修飾位點。這種O-GlcNAc修飾作用僅有兩種酶調控：O-GlcNAc轉移酶(OGT)及O-GlcNAc水解酶(OGA)。生物體內一些重要蛋白O-GlcNAc修飾作用的異常會引起生理功能的紊亂甚至造成機體死亡。早前的研究發現人大腦的Tau蛋白的O-GlcNAc水平的降低會引起其高磷酸化，進而引起阿爾茨海默病；線蟲中daf蛋白的高O-GlcNAc會造成胰島素信號衰弱現象；果蠅中Akt的高O-GlcNAc水平會加強胰島素樣信號通路。這些研究主要是基于基因水平，通過干涉OGT或OGA抑制其基因的表達來反映O-GlcNAc水平變化對于機體的影響。然而，通過基因敲除的手段往往引起一些其他正常基因的表達異常，造成不必要的麻煩。因此，從蛋白出發，根據其特殊的理化性質，用分子的方法來監控體內重要蛋白的O-GlcNAc水平顯得格外重要。?

亞洲玉米螟作為我國主要的農藥害蟲之一，它的預防及防治十分困難。目前尚沒有特效的化學農藥，而且由于其鉆蛀特性，施藥方法也費時費力。蛋白O-GlcNAc修飾作用無論在哺乳動物還是昆蟲中都是十分重要的，如果根據亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的結構信息，設計靶標小分子，從而影響亞洲玉米螟的生長發育，無論是研究價值還是商業價值都是巨大的。?

由于OGA的序列相似性比較低，因此基因獲取難度大，關于它的相關基因報導情況很少，其相關的重組表達更是屈指可數。因此本專利致力于獲得全新OGA的基因，并進行重組表達，通過對其蛋白性質的鑒定及后續晶體的獲得來研發小分子化合物，來調節機體內靶蛋白的O-GlcNAc水平。?

發明內容

本發明公開了一種全新的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因核苷酸序列，以及該序列所編碼的蛋白質的氨基酸序列，在獲得目的基因片段的基礎上，構建了OfOGA基因的重組表達載體，并將其轉化至大腸桿菌宿主細胞中表達OfOGA蛋白，將其應用于開發綠色農藥領域，也可設計小分子化合物應用于醫療，用于開發一些治療疾病(阿爾茨海默病和糖尿病)的藥物。?

本發明具體通過以下技術方案實現，?

本發明的一方面在于：一種亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：17所示。?

本發明的另一方面在于：上述的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因所編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：18所示。?

本發明的另一方面在于：上述的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶OfOGA基因的重組表達載體。?

具體的，上述的重組表達載體為大腸桿菌表達載體pET-28a(+)。?

本發明的另一方面在于：由上述重組表達載體所轉化得到的重組菌株。?

本發明的另一方面在于：上述重組菌株制備亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶的方法，包括如下步驟：設計引物擴增上述OfOGA基因；構建含有上述OfOGA基因的表達質粒；培養用該質粒所轉化的宿主細胞，經過篩選得到菌株；培養菌株，誘導蛋白表達；分離并純化所表達的蛋白。?

本發明的另一方面在于：上述亞洲玉米螟β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶蛋白在農藥、醫藥領域的應用。?

有益效果：本發明首先解決了亞洲玉米螟的β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶(OfOGA)的基因序列獲取問題，還是首例解決了昆蟲來源的OGA的重組表達問題。所獲得的重組菌株能大量表達OfOGA。另外，針對該酶的抑制劑還可作為對亞洲玉米螟的防治策略，從而達到對目標害蟲的防治，同時基于其結構的研究也可設計小分子化合物應用于醫療，用于開發一些治療疾病(阿爾茨海默病和糖尿病)的藥物。?

附圖說明

圖1：從5齡的亞洲玉米螟幼蟲中提取的總RNA的凝膠電泳分析圖；?

圖2：of-1的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；?

圖3：5′未知序列的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；?