[發(fā)明專利]檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110440641.5
• 申請(qǐng)日: 2011-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102533988A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦勝營(yíng);賀林;顧學(xué)范;許姍姍;沈陸
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C40B40/06
• 代理公司: 上海漢聲知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國(guó)中

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的基因芯片，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒。

背景技術(shù)

遺傳性代謝病(inborn?errors?of?metabolim，IEM)是因維持機(jī)體正常代謝所必需的由多肽和/或蛋白組成的酶、受體、載體及膜泵生物合成發(fā)生遺傳性缺陷及編碼這類多肽(蛋白)的基因發(fā)生突變而導(dǎo)致的一組疾病。大多為單基因病，屬常染色體隱性遺傳，總的發(fā)病率約0.5％～1％。隨著人們對(duì)此類疾病認(rèn)識(shí)的加深及實(shí)驗(yàn)分析技術(shù)的發(fā)展，該病的診斷率明顯上升，目前已達(dá)四五千種。此類疾病種類繁多，涉及到糖類、氨基酸、脂類等的代謝紊亂，臨床癥狀多種多樣，目前臨床診斷主要依靠于生化檢查及氨基酸、有機(jī)酸分析等，只有少數(shù)醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)可以對(duì)其中的某些疾病進(jìn)行基因診斷。而患者出現(xiàn)臨床改變時(shí)往往已經(jīng)嚴(yán)重影響了其生存質(zhì)量，所以常規(guī)的檢查方法無(wú)法對(duì)遺傳代謝病進(jìn)行早期診斷和產(chǎn)前診斷。

高苯丙氨酸血癥(hyperphenylalaninemia，HPA)是最常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的氨基酸代謝紊亂疾病，主要由四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin?deficiency，BH4)缺乏所致。四氫生物蝶呤缺乏癥是由于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸羥化酶的輔助因子BH4合成或代謝障礙所致，不但影響苯丙氨酸羥化酶的活性，引起苯丙氨酸代謝障礙而在體內(nèi)蓄積，同時(shí)影響腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺、5-羥色胺的合成，患兒出現(xiàn)嚴(yán)重的精神系統(tǒng)損害癥狀和體征，如運(yùn)動(dòng)障礙、肌張力異常、頑固性抽痙、肢體震顫、智能障礙等。如果僅給予低/無(wú)苯丙氨酸飲食治療，血苯丙氨酸濃度雖然能降至正常，但神經(jīng)系統(tǒng)癥狀日趨嚴(yán)重，預(yù)后極差。所以將四氫生物蝶呤缺乏癥與經(jīng)典型PKU進(jìn)行區(qū)分具有重要的臨床意義。

BH4是由三磷酸鳥(niǎo)苷在三磷酸鳥(niǎo)苷環(huán)化水解酶(GTPCH)、6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)和墨蝶呤還原酶(SR)的作用下合成，參與芳香族氨基酸羥化酶的催化反應(yīng)后，BH4被氧化為蝶呤-4a-二甲醇胺，再由蝶呤-4a-二甲醇胺脫水酶(PCD)和二氫蝶呤還原酶(DHPR)還原為具有活性的BH4。上述任一種酶的缺乏均可導(dǎo)致BH4缺乏癥，而6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)缺乏是BH4缺乏中最常見(jiàn)的類型。編碼6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶(PTPS)的基因是PTS基因，定位于11q22.3-23.3，mRNA長(zhǎng)921bp，包含6個(gè)外顯子，具有功能的PTPS是由兩個(gè)三聚體構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，有6個(gè)活性中心，其催化BH4的合成需要鎂離子和鋅離子的共同作用。目前已報(bào)道44種PTS基因突變類型，包括40種錯(cuò)義/無(wú)義突變，5種剪切突變，7種插入/缺失。目前對(duì)HPA進(jìn)行分型的方法一般是BH4負(fù)荷試驗(yàn)、尿蝶呤譜分析、DHPR活性測(cè)定等。隨著編碼6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶和二氫蝶呤還原酶基因分別于1992年和1987年克隆定位，使用6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶基因診斷HPA的報(bào)道也越來(lái)越多。然而，現(xiàn)在尚無(wú)一種快速、低成本、大通量和自動(dòng)化檢測(cè)PTS基因突變的方法。因此，需要一種新的技術(shù)方案來(lái)克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片及使用方法、試劑盒。本發(fā)明的基因芯片操作步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)特異性高，穩(wěn)定性好，時(shí)間短，成本低，適用于臨床患者基因突變檢測(cè)和正常人雜合子攜帶者檢測(cè)。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)，

第一方面，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡核苷酸探針，所述探針為SEQ?ID?NO.1-54所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述固相載體選自載玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚苯乙烯中的一種。

第二方面，本發(fā)明還涉及應(yīng)用前述基因芯片檢測(cè)6-丙酮酰四氫生物蝶呤合成酶缺乏癥的方法，包括多重PCR擴(kuò)增，所述的多重PCR擴(kuò)增特異性引物為：

SEQ?ID?NO.59-60所示的核苷酸，

SEQ?ID?NO.61-62所示的核苷酸，

SEQ?ID?NO.63-64所示的核苷酸，

SEQ?ID?NO.65-66所示的核苷酸，

SEQ?ID?NO.67-68所示的核苷酸，