[發明專利]一種用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用

有效

• 申請號: 201110440162.3
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102532411A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 郭天瑛;周德重;李從欣;胡玉玲
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C08F220/60
• 分類號: C08F220/60;C08F220/32;C08F2/38;C12N15/87
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發明屬于基因治療及新材料領域，具體涉及一種用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用。

背景技術

基因治療是一種利用分子生物學方法將目的基因導入患者體內，使之表達目的基因產物，從而使疾病得到治療的技術?；蜉d體是基因治療領域的核心技術之一?；蜉d體通常分為病毒載體和非病毒載體.在多數情況下，病毒載體的轉染效率高，但存在潛在毒性、免疫原性等問題，限制了其在臨床治療中的應用；非病毒載體雖然可以克服上述問題，但是不利的生物分布以及低效的胞內運轉，導致活性基因轉染率低.因此提高非病毒基因載體的轉染率是當前研究的關鍵。

陽離子聚合物，如殼聚糖、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨等是最為常用的幾種非病毒基因載體聚合物材料。這些聚合物材料作為基因載體材料的主要問題是，其與DNA或RNA形成的復合物粒子易在生理環境下對一些蛋白質產生特異性的相互作用而產生吸附，從而影響其細胞內吞作用以及從內涵體或溶酶體中逃逸的速度繼而影響轉染效率?？朔搯栴}的辦法主要通過化學改性的方式，如通過化學修飾方法在其結構中引入PEG鏈段，但是該方式往往同時也消耗了聚陽離子結構中的氨基，使其壓縮DNA的能力下降。

發明內容

本發明的目的是針對上述存在問題，提供一種用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物及應用，該功能性寡聚物制備工藝簡單、易于實施；該功能性寡聚物與其它聚陽離子材料一起用作非病毒基因載體，具有低細胞毒性、良好的抗血清穩定性和高的基因轉染效率，有望用于臨床基因治療。

本發明的技術方案：

一種用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)，由烯丙基組氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖單體2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙?；?β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙?；?β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通過以水溶性硫代酯作為分子量調節劑自由基聚合制得，分子量為0.5-20KDa，分子量分布為1.0-2.0，MA-His-OMe和MAEL摩爾比為3-15∶1。

一種所述用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的制備方法，以MA-His-OMe和MAEL為共單體，以2，2′-偶氮二(2-甲基丙腈)(AIBN)或4，4′-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)為引發劑，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)為連轉移劑制備，步驟如下：

1)以組氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑為原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)：

將4.8g苯并三氮唑溶解在25ml二氯甲烷中，加入1.2g二氯亞砜，攪拌30min后，加入0.86g甲基丙烯酸，繼續反應2h，有機相用濃度為2摩爾/升的氫氧化鈉溶液萃取三次，有機相用硫酸鈉干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，產物用快速層析柱純化，得到烯丙基苯并三氮唑。將1.87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml二氧六環中；將1.69g組氨酸甲酯溶解在10ml去離子水中，磁力攪拌條件下，調節其pH值為8.0，然后將溶解在二氧六環中的烯丙基苯并三氮唑緩慢滴加至上述組氨酸甲酯溶液中進行反應，并用薄層色譜監測反應進程，待薄層色譜顯示烯丙基苯并三氮唑消耗完全時，停止攪拌，用質量百分比濃度為10％的稀鹽酸調節溶液pH值至中性，旋蒸除去二氧六環，過濾除去不溶物并旋蒸除去水相，產物經冷凍干燥后溶解在無水乙醇中并過濾，再將濾液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe；

2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙?；?β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙?；?β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制備：

將20g乳糖、10g無水醋酸鈉加到120ml醋酸酐中，混合并在回流溫度下反應2h，反應結束后將產物倒入冰水中攪拌，過濾并用水洗滌固體三次，置于空氣中干燥，然后用乙醇重結晶得到八乙?；樘牵辉?0ml二氯甲烷中，加入5g八?；樘呛?.8ml甲基丙烯酸羥乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反應2h，然后室溫反應12h，反應結束后加入20ml去離子水，分離后依次用水、飽和碳酸氫鈉溶液和水洗滌二氯甲烷相至中性，然后用硫酸鈉干燥，旋蒸除去二氯甲烷并用色譜柱分離，得到MAEL；

3)用于非病毒基因載體材料的功能性寡聚物的制備：