[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)生物巰基的熒光探針及其制備方法與使用方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110439870.5
• 申請(qǐng)日: 2011-12-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102532178A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓益豐;劉靜
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07F5/02
• 分類(lèi)號(hào): C07F5/02;C09K11/06;G01N21/64;A61K49/00
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

1.一種檢測(cè)生物巰基的熒光探針的制備方法，其特征在于：該檢測(cè)生物巰基的熒光探針有兩部分組成：2,4-二硝基苯磺酰基為識(shí)別基團(tuán)，二氟化硼-二吡咯甲烷衍生物為信息報(bào)告功能團(tuán)，其結(jié)構(gòu)如下；

檢測(cè)生物巰基的熒光探針的制備路線如下：

檢測(cè)生物巰基的熒光探針的制備方法包括以下步驟：

步驟一，的制備：在氬氣的保護(hù)下，將0.6～1.2?g間羥基苯甲醛與1～2?g?2,4-二甲基吡咯加入150?mL?的二氯甲烷中，攪拌溶解后，再加入0.5?mL三氟乙酸，在室溫下攪拌反應(yīng)10～15小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，蒸干溶劑，以硅膠柱進(jìn)行分離；

步驟二，的制備：在氬氣的保護(hù)下，將1.2～2.4?g式II化合物溶于100?mL二氯甲烷中，并向反應(yīng)體系內(nèi)滴加溶有1.3～2.6?g?2,3-二氯-5,6-二氰對(duì)苯醌（DDQ）的二氯甲烷溶液100?mL，繼續(xù)攪拌反應(yīng)4～6小時(shí)后，將體系以冰浴冷卻，再向反應(yīng)體系內(nèi)快速滴入10?mL三乙胺和15～30?mL三氟化硼的乙醚溶液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3～4小時(shí)，減壓除去溶劑，殘留物溶于100?mL二氯甲烷中，以100?mL水分兩次洗滌后，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓除去溶劑，殘留物用硅膠柱層析進(jìn)行純化；

步驟三，探針?lè)肿拥闹苽洌涸跉鍤獾谋Ｗo(hù)下，將0.5～1?g式III化合物溶于50?mL二氯甲烷中，以冰浴冷卻，并加入0.5?mL三乙胺，攪拌10～15分鐘后，向反應(yīng)體系內(nèi)滴加溶有1.2～2.4?g?2,4-二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液20?mL，待滴加完全后，升至室溫繼續(xù)攪拌10～15小時(shí)，減壓除溶劑，粗產(chǎn)品用硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，以二氯甲烷：石油醚?=?10：3為洗脫劑洗脫，得到探針?lè)肿蛹兤贰?/p>

2.一種檢測(cè)生物巰基的熒光探針的使用方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

步驟一，測(cè)量探針?lè)肿拥暮舜殴舱癫ㄗV及高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)

步驟二，測(cè)定探針?lè)肿訉?duì)巰基的選擇性

將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再用PBS緩沖液配置成溶液；分別加入以PBS緩沖液溶解的待測(cè)樣品，使最終探針?lè)肿拥臐舛葹?.1?μM，而待測(cè)樣品的濃度為2?mM；反應(yīng)0.5小時(shí)后在熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而確定探針?lè)肿訉?duì)巰基的選擇性；

步驟三，測(cè)定探針?lè)肿訉?duì)L-半胱氨酸的熒光-濃度曲線

將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再用PBS緩沖液配置成溶液；分別加入不同濃度的L-半胱氨酸，使最終探針?lè)肿拥臐舛葹?.1?μM；反應(yīng)0.5小時(shí)后在熒光光譜儀上進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而得到熒光強(qiáng)度對(duì)濃度變化的曲線；

步驟四，測(cè)定探針?lè)肿訉?duì)L-半胱氨酸的熒光-時(shí)間曲線

將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再用PBS緩沖液配置成溶液；分別加入不同濃度的L-半胱氨酸，使最終探針?lè)肿拥臐舛葹?.1?μM，而L-半胱氨酸的濃度為2?mM；反應(yīng)一定時(shí)間，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，進(jìn)而得到熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間變化的曲線；

步驟五，探針?lè)肿訉?duì)Mel細(xì)胞中活性巰基的熒光成像檢測(cè)

待測(cè)Mel細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌三次后，加入20?μM的熒光探針?lè)肿樱?7℃下孵育10分鐘后，再用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞三次，然后進(jìn)行熒光成像檢測(cè)。