[發明專利]雞球蟲ADF重組卡介苗及制備方法

有效

• 申請號: 201110439688.X
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102552893A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張西臣;李建華;李運娜;宮鵬濤;程柏淇;張國才;楊舉;李赫;陳玉江;任文陟
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K39/012
• 分類號: A61K39/012;C12N15/66;A61P33/02
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種雞球蟲ADF重組卡介苗，是通過以下方法制成的：首先獲得雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊，提取RNA，反轉錄成cDNA，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，與PMD-18T載體連接進行克隆，測序鑒定正確后，酶切回收目的片段，再分別與用同種酶進行酶切反應的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體PMV261和整合表達載體PMV361相連，連接正確的重組質粒轉化到BCG中，經抗性篩選和PCR鑒定，獲得陽性雞柔嫩艾美耳球蟲重組卡介苗。

2.?權利要求1所述的雞球蟲ADF重組卡介苗，包括穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗和整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗。

3.?權利要求2所述穿梭表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟：

將構建的柔嫩艾美耳球蟲雜交蟲株F2cDNA表達文庫中篩選出ADF基因，根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物進行PCR，TA克隆；

測序鑒定正確的質粒進行酶切，回收目的片段，與同種酶切的pMV261穿梭表達載體進行連接，將連接產物轉入DH5α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADF-261經電穿孔轉化到卡介苗中，37℃培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后，45℃熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Western?blotting?鑒定；

其中，

上游引物AD1：?5?AGCTGCAG?ATG?GCG?AGC?GGA?ATG?CCA?GTC?3；

下游引物AD：5?GAATCGAT?CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3；。

4.?權利要求2所述整合表達載體球蟲重組卡介苗疫苗的制備方法，包括以下步驟：

根據已克隆的柔嫩艾美耳球蟲ADF基因序列的開放閱讀框設計引物并引入酶切位點，進行PCR，TA克隆，對測序鑒定正確的質粒進行雙酶切，回收目的片段，與同種酶切的pMV361整合表達載體進行連接，轉入DH5α感受態細胞中，提取質粒，將重組質粒ADF-361經電穿孔法轉化到卡介苗中，37℃培養至對數生長期后，挑去菌落，篩選BCG重組子，PCR方法證實為陽性克隆后，45℃熱誘導表達，對該表達產物進行SDS-PAGE電泳分析及Western?blotting?鑒定；

其中，

上游引物AD2：5?AGCAGCTGATGGCGAGCGGAATGCCAGTC3；

下游引物AD：5?GAATCGAT?CTAATGGAGCACGCTTAGGTC3。