[發明專利]利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學方法

有效

• 申請號: 201110439111.9
• 申請日: 2011-12-23
• 公開（公告）號: CN102495115A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 吳沿友;牛慧樣;王坤;劉倩;董曉婭;趙寬;朱詠莉
• 申請（專利權）人: 中國科學院地球化學研究所;江蘇大學;鎮江梧之現代農業有限公司
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/327
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及一種利用酶電極檢測根系分泌物中蘋果酸的方法，屬于生化分析領域。

背景技術

根系分泌物是植物生長過程中向根際釋放的一類物質。廣義的根系分泌物是植物根系釋放到根際環境中各種物質的總稱，而狹義的根系分泌物是指植物根系通過溢泌作用釋放到根際環境中各種可溶性有機物的總稱。根系分泌物的種類繁多，目前已鑒定出來的有機化合物有200多種，主要包括有機酸、糖類、氨基酸和酚酸（化感物質）等低分子量的有機物，還包括類似于黏膠和酶之類的高分子量有機物質。在根系分泌物的眾多物質中，低分子量有機酸是研究最為廣泛也是最為重要的一類物質。根系分泌物中低分子量有機酸主要包括諸如甲酸，乙酸，草酸，蘋果酸，丁二酸，馬來酸，檸檬酸，富馬酸等等。其中蘋果酸是根系分泌物中的重要有機酸，在特定的植物中，根系分泌的蘋果酸量不僅與根系分泌的有機酸總量有顯著的正相關，而且還與草酸、檸檬酸等呈現顯著的正相關，因此，測定根系分泌的蘋果酸量可以評價某一物種在特定條件下的有機酸分泌情況。

???根系分泌物的成分復雜，目前，常見的測定根系分泌物中的蘋果酸的氣相色譜法（GC）、離子色譜法（IC）和高效液相色譜法（HPLC）等方法，都需要繁雜的前處理過程，而且常常出現靈敏度低、效果不理想的情況。同時這些方法還存在單個樣品分析時間長，色譜柱易污染，分析價格昂貴的缺陷。

生物傳感器是一個非常活躍的研究和工程技術領域，它與生物信息學、生物芯片、生物控制論、仿生學、生物計算機等學科一起，處在生命科學和信息科學的交叉區域。生物傳感器研究起源于20世紀的60年代，1967年Updike和Hicks把葡萄糖氧化酶(GOD)固定化膜和氧電極組裝在一起，首先制成了第一種生物傳感器，即葡萄糖酶電極。到80年代生物傳感器研究領域已基本形成。其標志性事件是：1985年“生物傳感器”國際刊物在英國創刊；1987年生物傳感器經典著作在牛津出版社出版；1990年首屆世界生物傳感器學術大會在新加坡召開，并且確定以后每隔二年召開一次。此后包括酶傳感器的生物傳感器研究逐漸興旺起來，從用一種或多種酶作為分子識別元件的傳感器，逐漸發展設計出用其他的生物分子作識別元件的傳感器。酶傳感器的優點有穩定性好，分析精度高、分析成本最低、品種多，應用范圍廣、分析速度快。要在眾多成分共存的根系分泌物中測定蘋果酸,?利用蘋果酸及其蘋果酸脫氫酶的專一性，制作生物傳感器進行檢測，將提高檢測的特異性，同時能達到簡便、快速、靈敏的效果。

石墨烯(Graphene),它是2004年由曼徹斯特大學的科斯提亞??諾沃謝夫和安德烈??蓋姆小組首先發現的。自發現以來，石墨烯受到了全世界科學家的廣泛關注。純石墨烯是一種只有一個原子厚的結晶體，具有超堅固、超強導電性、優異的電學、熱學和力學性能等特性。石墨烯納米復合物作為一種新型的高性能材料，不僅保持了石墨烯的一系列優良性能，還具有純石墨烯材料不具有的其它優良性能如催化活性和易分散性等，從而為石墨烯的廣泛應用提供了前提條件。由于石墨烯納米復合物良好的導電性，將其應用于生物傳感可提高裝置的靈敏度、響應速度和抗干擾能力等一系列性能，這是目前許多材料制作的生物傳感器無法比擬的。應用石墨烯納米復合物作材料制作蘋果酸脫氫酶電極，建立酶電極傳感器檢測根系分泌物中的蘋果酸，可達到靈敏度高、檢測限低、特異性好、儀器簡單便宜、操作簡便快速的效果。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，提供一種利用生物酶電極法檢測根系分泌物中蘋果酸的電化學方法，該方法用石墨烯納米復合物作為一種新型的高性能材料，修飾電極制備蘋果酸脫氫酶電極，直接測定根系分泌物中的蘋果酸，以克服其它方法中樣品的處理較為復雜，單個樣品分析時間長，色譜柱易污染，干擾因素多的缺點。

本發明采取以下技術方案，它包括以下過程：第一，制作蘋果酸脫氫酶（MDH）電極；第二，蘋果酸脫氫酶電極、飽和甘汞電極和鉑絲電極與電化學工作站連接，在焦磷酸鈉緩沖體系下研究該電極反應的優化條件；第三，在恒溫電磁攪拌下，設置操作電壓，待背景電流穩定后，連續加入一定濃度的蘋果酸溶液到電解池中，利用恒電位計時電流法，測定不同蘋果酸濃度下相應的電流變化值，得到一個催化電流與蘋果酸濃度的線性范圍，要求在實際檢測過程中結果必須在這個線性范圍內；第四，加入根系分泌物樣品到電解池中，利用恒電位計時電流法，在恒溫電磁攪拌下，將電流的增加值作為y軸，純蘋果酸標準溶液加入量作為x軸，繪制標準曲線，依據標準曲線求y=0時的x值，此時x的絕對值就是稀釋一定倍數后樣品中的蘋果酸的濃度。