[發明專利]一株高效轉化去氫表雄酮的菌株及其應用

有效

• 申請號: 201110438752.2
• 申請日: 2011-12-26
• 公開（公告）號: CN102517222A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發明（設計）人: 許正宏;吳燕;史勁松;李會;李恒;張旦旦;許泓瑜
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P33/06;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一株赤霉菌(Gibberella?intermedia)CA3-1及其高效轉化去氫表雄酮為7α-羥基-去氫表雄酮的方法。

背景技術

去氫表雄酮(DHEA)和7α-羥基-去氫表雄酮(7α-OH-DHEA)是自然界生物體內重要的活性物質，對代謝具有重要的調節作用，而后者是前者在生物體內的氧化代謝產物，和DHEA有共同的免疫調節作用。目前，有研究發現7α-OH-DHEA在阻止體外神經元的缺氧細胞死亡方面比DHEA活性更強；其抗氧化活性也超過DHEA；另外，7α-OH-DHEA的抗腫瘤作用明顯，對腫瘤的增生有極強的抑制作用。由于7α-OH-DHEA較強的免疫調節功能和抗腫瘤作用，將其作為一種具有重要藥理作用和藥用價值的羥基甾體化合物，應用前景十分看好，成為當前藥物研究領域中的熱點之一。

合成7α-OH-DHEA的傳統方法是采用相同或相近的結構母核類似物進行化學合成，但是7α-OH-DHEA對立體選擇性要求高，通常會造成產物得率低，副產物多，產品后續分離純化過程復雜等問題。近年來，國內外研究者開始考慮生物轉化法將DHEA特異性轉化為7α-OH-DHEA，該反應具有條件溫利，安全低耗、易操作、轉化率高且環境友好等特點。據相關文獻報道，目前已有總狀毛霉(Mucor?racemosus)等菌株具備轉化DHEA為7α-OH-DHEA的能力。但由于DHEA是脂溶性化合物，在水相中溶解度極低，造成轉化過程中底物投料濃度和轉化效率都非常低，這些問題直接成為7α-OH-DHEA工業生產中的瓶頸。因此，篩選一株高效轉化DHEA的微生物具有非常重要的意義，而目前關于赤霉菌(Gibberella?intermedia)CA3-1用于轉化DHEA的研究未見報道，其高底物投料濃度更是工業生產的一大優勢。

發明內容

本發明的目的在于提供一株高效轉化DHEA的赤霉菌(Gibberella?intermedia)CA3-1，以及利用該菌株轉化DHEA為7α-OH-DHEA的方法，可達到高底物投料濃度、高底物高轉化率、高產物得率的要求。

本發明的發明人從國內合成甾體化合物的化工廠廠房周圍的士壤樣品中分離篩選獲得一株赤霉菌(Gibberella?intermedia)CA3-1，該菌于2011年5月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.4903。

應用上述微生物轉化DHEA生產7α-OH-DHEA的方法，其步驟如下：

(1)采用保藏號為CGMCC?No.4903的赤霉菌(Gibberella?intermedia)CA3-1為生產菌種，按照常規方法進行活化培養得到種子液，將該種子液涂布到PDA培養基上；

(2)制備CA3-1菌株的細胞液體培養物：挑取步驟(1)的PDA固體培養基上的CA3-1菌株一環，接種于已滅菌的裝有20-60mL種子培養基的250mL錐形瓶中，培養溫度為25-40℃，置搖床上以120-220r/min的轉速培養12-16h至對數生長中期，即得到CA3-1菌株的細胞液體培養物；

(3)發酵培養：將步驟(2)中制備好的細胞液體培養物以4-8％(w/w)的接種量接入發酵培養基，裝液量為250mL錐形瓶中裝20-60mL發酵培養基，培養溫度為25-40℃，在120-220r/min的轉速下培養20-24h，得發酵液。

(4)生物轉化：精確稱取適量DHEA，投入步驟(3)中的菌體發酵液，使其終濃度為5-8g/L，在轉化溫度28℃，200-220r/min的轉速下轉化36-48h，即得轉化液。

(5)產物檢測：將步驟(4)的轉化液在8000-12000r/min下離心5-10min，上清用等體積乙酸乙酯抽提3次，沉淀用適量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋轉蒸發儀中旋至有晶體出現，乙腈復溶晶體并通過0.22μm的有機膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析DHEA和7α-OH-DHEA的含量。